五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜的體外抑制作用

馮銳基，龐歡瑛，2*，黃郁蔥，2，簡紀(jì)常，2

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088)

五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜的體外抑制作用

馮銳基1，龐歡瑛1，2*，黃郁蔥1，2，簡紀(jì)常1，2

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088)

摘要[目的]明確五倍子(Rhus chinenis)、石榴皮(Folium sennae)對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)及其生物膜的體外抑制作用。[方法]采用瓊脂擴(kuò)散法，分別測定五倍子、石榴皮對溶藻弧菌的體外抑菌作用；選用倍比稀釋法確定五倍子、石榴皮對溶藻弧菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)；采用改良微孔板法評價(jià)2種中草藥液對溶藻弧菌生物膜形成的影響。[結(jié)果] 2種中草藥都有不同程度的抑制溶藻弧菌的作用，五倍子對溶藻弧菌的抑菌圈直徑為(16.37±0.14)mm，MIC和MBC均為6.25 mg/mL；石榴皮對溶藻弧菌的抑菌圈直徑為(12.37±0.06)mm，MIC和MBC分別為12.50、25.00 mg/mL。當(dāng)藥物濃度在1.56 mg/mL及以上時(shí)，五倍子對溶藻弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用；藥物濃度在6.25 mg/mL及以上時(shí)，石榴皮對溶藻弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用。[結(jié)論]五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜均有抑制作用。

關(guān)鍵詞五倍子；石榴皮；溶藻弧菌；體外抑制作用；生物膜

溶藻弧菌屬于弧菌科弧菌屬，革蘭氏陰性短桿菌，能在有氧或無氧的環(huán)境中生長、繁殖，單個(gè)存在或尾端相連接形成“S”或“C”形[1]。溶藻弧菌廣泛存在于海水區(qū)及河口處[2]，在海水型弧菌中居于首位[3]，能引發(fā)魚、蝦、貝、蟹等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病，嚴(yán)重危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)[4]。

細(xì)菌生物膜是指由附著于惰性或活性實(shí)體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹著細(xì)菌的水合性基質(zhì)所構(gòu)成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落[5]。研究表明，大部分細(xì)菌在適宜條件下都可形成生物膜[6]，處于生物膜狀態(tài)下的細(xì)菌能輕易逃避抗生素和宿主的免疫機(jī)制，對細(xì)菌病的預(yù)防和治療造成困難。目前，關(guān)于細(xì)菌生物膜防治成為研究熱點(diǎn)。五倍子和石榴皮是常用的中草藥，在防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病中有著廣泛應(yīng)用。張明等[7]研究發(fā)現(xiàn)五倍子對鰻弧菌的抑菌效果顯著，金珊等[8]研究發(fā)現(xiàn)石榴皮對哈氏弧菌的抑菌效果較好，但關(guān)于這2種中藥對溶藻弧菌及其生物膜抑制作用的研究還鮮見報(bào)道。鑒于此，筆者研究了五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜的體外抑制作用，以期為應(yīng)用中藥防治由溶藻弧菌引起的弧菌病提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。溶藻弧菌HY9901由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自廣東省湛江海域患病紅笛鯛(Lutjanuserythopterus)魚體中分離并保存[9]。五倍子、石榴皮購自廣東省湛江春天藥房。

1.1.2主要儀器。-80 ℃超低溫冰箱購自山東省青島海爾公司；SZ-93自動(dòng)雙重雙蒸水蒸餾器購自上海市亞榮生化儀器廠；自動(dòng)高壓滅菌鍋(HVE-50)購自日本Hirayama公司；恒溫培養(yǎng)箱購自上海市博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3藥劑與試劑。胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)：大豆蛋白胨5.00 g，胰蛋白胨15.00 g，NaCl 20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL(調(diào)pH至7.2)，高壓滅菌，4 ℃保存。胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)：大豆蛋白胨5.00 g，胰蛋白胨15.00 g，瓊脂粉15.00 g，NaCl 20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL(調(diào)節(jié)pH至7.2)。四甲基偶氮唑鹽(MTT)的配制：將0.50 g MTT溶于 100 mL磷酸緩沖液(PBS)中，用 0.22 μm濾膜過濾以去除溶液中的細(xì)菌，4 ℃避光保存。PBS：Na2HPO41.44 g，NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，KH2PO40.24 g，調(diào)pH至7.4，定容至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌，室溫保存。0.85%生理鹽水：將0.85 g NaCl用蒸餾水定容至1 000 mL，高壓滅菌后保存。

1.2方法

1.2.1溶藻弧菌的培養(yǎng)。菌株接種在含2%NaCl的TSB中，28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)18 h。用無菌TSB將菌懸液的密度調(diào)至OD600=0.8(約1×108cfu/mL)備用[10]。

1.2.2中草藥水煎液的制備。包括浸泡、煎煮、過濾和濃縮4道工序：稱取中草藥20.00 g，剪碎后放入裝有400 mL蒸餾水的陶瓷鍋中，浸泡約4 h，加熱至沸騰后，改文火煎煮40 min；煎好的中草藥冷卻后立即用8層紗布過濾，藥渣用蒸餾水重復(fù)煎煮1次，合并2次濾液；加熱濾液濃縮至20 mL，冷卻后裝于小藥瓶中，制得終濃度為1 g/mL的中草藥水煎液，于4 ℃冰箱保存。

1.2.3藥物體外抑菌試驗(yàn)。采用瓊脂擴(kuò)散法。向滅菌的平板內(nèi)倒入TSA培養(yǎng)基10 mL，冷凝后備用。每種藥液設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組，分別向平板加100 μL菌液，涂抹均勻，然后用打孔器在每個(gè)平板上打3個(gè)孔(每孔直徑為6.00 mm，且兩孔距離不小于2 cm)，每孔加入30 μL藥液，另設(shè)1個(gè)涂有菌液的平板作對照。將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果，并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈。抑菌效果判定：抑菌圈直徑≥20 mm為強(qiáng)抑菌作用，用“+++”表示；抑菌菌直徑在15～20 mm為中等抑菌作用，用“++”表示；抑菌圈直徑在10～15 mm為弱抑菌作用，用“+”表示；抑菌圈直徑≤10 mm為無抑菌作用，用“-”表示。

1.2.4MIC的測定。采用倍比稀釋法。試驗(yàn)組設(shè)9支無菌試管，編號為1～9，每支試管加入TSB 2 mL，向1號管加入1 g/mL藥液2 mL，充分混勻后，從1號管中取出2 mL移入2號管，以此類推直至稀釋到9號管，從中吸出藥物混液2 mL，丟棄，再向前7支管各加入菌液20 μL，8號管作為陰性對照管，9號管作為空白對照管。最后將所有管置于28 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h。無細(xì)菌生長的稀釋管的藥物濃度即為供試藥物對溶藻弧菌的MIC。

1.2.5MBC的測定。從測定MIC的試管中取細(xì)菌生長不明顯的試管，從中取100 μL涂布于TSA平板，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。TSA平板上無細(xì)菌生長且含藥液濃度最低管的藥液濃度即為供試藥物對溶藻弧菌的MBC[11]。

1.2.6溶藻弧菌生物膜的形成與定量檢測。采用MTT法[11]。具體步驟：①生物膜培養(yǎng)。將菌懸液按1∶100比例稀釋到新鮮TSB中；將稀釋好的混液以每孔200 μL加入96孔板中，每組設(shè)8個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)無菌TSB對照孔；在28 ℃濕盒中靜止孵育。②染色。慢慢吸取培養(yǎng)液，用 PBS 緩沖液輕輕洗滌未黏附的菌細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基后，每孔加入二甲基亞砜150 μL，置搖床上低速振蕩 10 min。③定量檢測。用酶標(biāo)儀測定OD(490 nm)值。各孔OD值與調(diào)零孔平均值之差代表各孔生物膜的代謝活性。

1.2.7不同培養(yǎng)時(shí)間對溶藻弧菌成膜的影響試驗(yàn)。溶藻弧菌接種于96孔板后，置于28 ℃濕盒中靜止培養(yǎng)，每隔4～6 h取樣，按“1.2.6”方法測定成膜情況。

1.2.8中草藥液對溶藻弧菌生物膜形成的影響試驗(yàn)。在無菌條件下，把細(xì)菌懸浮液與新鮮TSB按1∶100的比例混合均勻，加入中草藥水煎液，倍比稀釋后，分別上樣200 μL至96孔板中，每組設(shè)8個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)置陽性對照組[含0.1 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]、陰性對照組(含培養(yǎng)基和菌液)和僅含培養(yǎng)基的空白對照組，28 ℃濕盒中培養(yǎng)24 h，按“1.2.6”方法測定成膜情況。同上述方法設(shè)立無菌的藥物對照組。

1.2.9數(shù)據(jù)處理。應(yīng)用SPSS Statistics17.0 軟件中的成對樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.12種中草藥的抑菌效果由表1可知，五倍子對溶藻弧菌有中等抑菌作用，石榴皮有弱抑菌作用。

表1五倍子和石榴皮對溶藻弧菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

Table 1Antibacterial effect ofFoliumsennaeandRhuschinenisagainstVibrioalginolyticus

中草藥Chineseherbalmedicine抑菌圈直徑Diameterofinhibitionzone∥mm抑菌效果Antibacterialeffect五倍子Rhuschinenis16.37±0.14++石榴皮Foliumsennae12.37±0.06+

2.2MIC和MBC測定結(jié)果由表2可知，五倍子的抑菌效果較好，MIC和MBC均為6.25 mg/mL。石榴皮的抑菌作用較弱，MIC和MBC分別為12.50、25.00 mg/mL。

表2五倍子和石榴皮對溶藻弧菌的MIC和MBC

Table 2TheMICandMBCofFoliumsennaeandRhuschinensisagainstVibrioalginolyticus

mg/mL

2.3溶藻弧菌生物膜生長曲線由圖1可知，溶藻弧菌生物膜的生長周期：2～4 h為初始定植階段，8～16 h為黏附階段，20～24 h為成熟階段，36 h開始解聚。

圖1　溶藻弧菌生物膜生長曲線Fig.1　Growth cure of Vibrio alginolyticus biofilm formation

2.4不同藥物濃度對溶藻弧菌生物膜形成的影響由圖2可知，與未加藥陰性對照孔相比較，五倍子藥物濃度在0.78 mg/mL及以下時(shí)，其對溶藻弧菌生物膜的抑制作用無顯著差異；五倍子濃度在1.56 mg/mL及以上時(shí)，其對溶藻弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用。

注：**表示P<0.01Note：** indicated P < 0.01.圖2　五倍子對溶藻弧菌生物膜形成的影響Fig.2　Effects of Rhus chinensis on the formation of Vibrio alginolyticus biofilm

由圖3可知，與陰性對照相比較，石榴皮藥物濃度在3.13 mg/mL及以下時(shí)，其對溶藻弧菌生物膜的抑制作用無顯著差異；石榴皮濃度在6.25 mg/mL及以上時(shí)，其對溶藻弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用。

注：**表示P<0.01Note：** indicated P < 0.01.圖3　石榴皮對溶藻弧菌生物膜形成的影響Fig.3　Effects of Folium sennae on the formation of Vibrio alginolyticus biofilm

3結(jié)論與討論

該研究表明，五倍子和石榴皮對溶藻弧菌及其生物膜均有抑制作用。在藥物成分中，當(dāng)化學(xué)鍵振動(dòng)的波長等于某種細(xì)菌的長度時(shí)會(huì)發(fā)生共振，化學(xué)鍵的共振有殺菌作用，鞣質(zhì)中的O-H 鍵波長在很多細(xì)菌長度范圍以內(nèi)[12]。鞣質(zhì)可凝固微生物體內(nèi)的原生質(zhì)及多種酶，對多種細(xì)菌、真菌、酵母菌都有明顯的抑制作用。鞣質(zhì)是五倍子的主要有效成分，研究表明五倍子對多種弧菌具有抑制作用。例如，張曉君等[13]研究了哈氏弧菌對中草藥的敏感性，發(fā)現(xiàn)五倍子具有極強(qiáng)的抑菌作用；李忠琴等[14]研究了中藥對鰻鱺病原菌的體外抑制作用，發(fā)現(xiàn)五倍子的抑菌作用最強(qiáng)；王玉娥等[15]發(fā)現(xiàn)五倍子對溶藻弧菌有明顯的殺菌作用，其MIC、MBC均為1.56 mg/mL。該研究探索了五倍子對溶藻弧菌的體外抑菌作用，結(jié)果表明：五倍子對溶藻弧菌有中等抑菌作用(++)，其抑菌圈直徑為(16.37±0.14)mm，MIC和MBC均為6.25 mg/mL；五倍子除了有抑菌作用外還能抑制生物膜的形成，加藥液的成膜量明顯小于未加藥，隨著五倍子濃度的增加其抑制生物膜生長的效果逐漸增強(qiáng)，當(dāng)五倍子濃度在1.56 mg/mL及以上時(shí)，其對溶藻弧菌生物膜的形成有極顯著抑制作用。

現(xiàn)代藥理研究表明，石榴皮中的鞣質(zhì)、黃酮類化合物是其抗菌的活性組分[16]。陳霞等[17]對47種中草藥體外抑殺嗜水氣單胞菌的藥效試驗(yàn)結(jié)果表明石榴皮的抑菌和殺菌效果最好。梁利國等[18]發(fā)現(xiàn)石榴皮對鰻弧菌、副溶血弧菌、河口弧菌及霍亂弧菌等細(xì)菌具有較好的抑菌和殺菌作用。該研究探索了石榴皮對溶藻弧菌的體外抑菌作用，結(jié)果表明：石榴皮的抑菌效果為弱抑菌(+)，抑菌圈直徑為(12.37±0.06)mm，其MIC和MBC分別為12.50、25.00 mg/mL；石榴皮除了抑菌作用外還能抑制生物膜的形成，石榴皮濃度在6.25 mg/mL及以上時(shí)明顯抑制了生物膜的生長。

該試驗(yàn)證明了五倍子和石榴皮這2種中草藥對溶藻弧菌的游離菌及其生物膜形成具有抑制作用，對致病性弧菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治具有參考意義。但該試驗(yàn)是在細(xì)菌相對穩(wěn)定的生長環(huán)境中進(jìn)行的，并未考慮到環(huán)境和用藥方式等對藥效的影響，具有一定的局限性，今后應(yīng)在養(yǎng)殖環(huán)境和用藥方法方面進(jìn)行綜合研究。此外，雖然中草藥以其資源豐富、天然綠色、高效低毒、抗藥性不顯著且兼有藥物性和營養(yǎng)性的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于各種水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疾病的預(yù)防和控制，并取得了一定的成果，但目前中草藥防治魚病的知識和經(jīng)驗(yàn)尚不能滿足生產(chǎn)上的需要，國內(nèi)外相關(guān)研究較少，并且中草藥的有效成分復(fù)雜，其類型、含量受遺傳因素、外界環(huán)境、地域性和季節(jié)性影響較大，分子結(jié)構(gòu)難以鑒定，今后既要研究漁用中草藥的主要成分和功效，又要廣泛開展應(yīng)用研究，篩選出防治效果理想的中草藥配方，從而達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。

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Inhibitory Activity ofRhuschinenisandFoliumsennaeonVibrioalginolyticusand Its Biofilm

FENG Rui-ji1, PANG Huan-ying1，2*, HUANG Yu-cong1，2et al

(1. College of Fisheries, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524088; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals, Zhanjiang, Guangdong 524088)

Abstract[Objective] To detect the inhibitory effects of Rhus chinenis and Folium sennae on Vibrio alginolyticus and its biofilm. [Method] The inhibitory effects of R. chinenis and F. sennae on V. alginolyticus were tested by agar diffusion method. The MIC and MBC were detected by the double dilution; the effects of R. chinenis and F. sennae on V. alginolyticus biofilm were measured by improved micro plate method. [Result] Two species of Chinese herbal medicines had different degrees of inhibition. R. chinenis had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone (DIZ) of (16.37 ± 0.14) mm, and the MIC and MBC were 6.25 mg/mL; F. sennae had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone (DIZ) of (12.37 ± 0.06) mm, and the MIC and MBC respectively were 12.50 and 25.00 mg/mL, respectively. Both R. chinenis and F. sennae exhibited a potent inhibitory activity against V. alginolyticus biofilm formation. [Conclusion] R. chinenis and F. sennae can significantly inhibit V. alginolyticus and its biofilm.

Key wordsRhus chinenis; Folium sennae; Vibrio alginolyticus; In vitro inhibitory activity; Biofilm

基金項(xiàng)目廣東省教育廳基礎(chǔ)研究重大培育項(xiàng)目(2014GKXM046)；廣東高校國際合作創(chuàng)新平臺項(xiàng)目(2013gjhz0008)；廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強(qiáng)校項(xiàng)目(GDOU2015050216)。

作者簡介馮銳基(1990- )，男，廣東肇慶人，本科生，專業(yè)：水產(chǎn)養(yǎng)殖。*通訊作者，副教授，博士，從事水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害研究。

收稿日期2016-03-15

中圖分類號S 941.43

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-001-03