家蠶核型多角體病毒對兩廣二號和桂蠶N2創(chuàng)傷感染的差異性分析

唐亮，石美寧，王霞，黃旭華，黃深惠，陳小青，胡文娟

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市 530007）

家蠶核型多角體病毒對兩廣二號和桂蠶N2創(chuàng)傷感染的差異性分析

唐亮，石美寧，王霞，黃旭華，黃深惠，陳小青，胡文娟

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市 530007）

以桑蠶抗性品種桂蠶N2和常規(guī)品種兩廣二號為對象，用昆蟲針在蠶體表制造創(chuàng)口接種新采集的核型多角體病毒（BmNPV），研究它們感染BmNPV的差異。結(jié)果顯示兩廣二號的BmNPV創(chuàng)傷感染半數(shù)致死濃度（LC50）為2.46×106PDV/mL，相當于膿病末期蠶血液稀釋264倍的值，屬于易感品種。而同等條件下桂蠶N2的LC50為2.21×108PDV/mL，相當于稀釋不到3倍的值，對核型多角體病毒耐受度顯著高于前者，具有很強的抗核型多角體病毒創(chuàng)傷感染的能力。飼養(yǎng)桂蠶N2能顯著減少蠶期創(chuàng)傷感染BmNPV的幾率。

核型多角體病毒；創(chuàng)傷感染；穿刺；桂蠶N2

家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV）屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬［1］，是目前廣西蠶業(yè)生產(chǎn)中危害最為嚴重的家蠶血液型膿病病原。在蠶業(yè)生產(chǎn)中，家蠶感染該病毒后沒有很好的治療手段，主要以預(yù)防為主，近些年抗性蠶品種的出現(xiàn)，使得抵御BmNPV有了更多的選擇。其中桑蠶新品種桂蠶N2對病毒經(jīng)口感染的抵抗性高于兩廣二號近1 000倍［2］，對防范農(nóng)民朋友養(yǎng)蠶中暴發(fā)血液型膿病有十分積極的作用。BmNPV以食下傳染為主，但也可通過傷口感染。部分蠶農(nóng)為了追求更大收益，蠶頭密度往往偏高，易發(fā)生相互抓傷［3，4］，增大經(jīng)傷口感染BmNPV的幾率。目前，已有研究顯示增加蠶頭密度能提高兩廣二號的血液型膿病發(fā)病率［3，4］，但未見BmNPV經(jīng)創(chuàng)傷感染抗性蠶品種的報道，本文以抗性品種桂蠶N2和常規(guī)品種兩廣二號為對象，研究它們傷口感染BmNPV的差異。

1 材料與方法

1.1 供試蠶品種

原種：932×芙蓉；一代雜交種：兩廣二號正交、桂蠶N2正交，均由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站提供。

1.2 供試病原

家蠶核型多角體病毒病毒株為廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站桑蠶病蟲害研究室保存。

1.3 用具

0#昆蟲針，血球計數(shù)板（25大格×16小格），尼康E100顯微鏡，尼康體視顯微鏡，超凈工作臺。

1.4 試驗方法：

1.4.1 制備新鮮BmNPV病毒及其梯度濃度 取核型多角體病毒株1×107個多角體/mL，均勻涂抹于桑葉表面，添食932×芙蓉4齡起蠶12 h之后轉(zhuǎn)正常桑葉飼養(yǎng)，經(jīng)過約84 h，蠶體表現(xiàn)出行動狂躁、環(huán)節(jié)和節(jié)間膜腫脹、蠶體呈乳白色，選取有以上特征的活蠶，用75%的酒精消毒蠶體，晾干后剪尾角取血液，冷藏備用（新制病毒在6 h內(nèi)使用）。本實驗主要模擬蠶創(chuàng)傷感染，使用BmNPV病蠶全血進行穿刺，鑒于細胞釋放型病毒（cell-released virus，CRV）定量步驟復(fù)雜且準確度一般，本文采用對多角體衍生病毒粒子（polyhedronderived virus，PDV）定量輔助評估血液中病毒粒子的值。即在顯微鏡下（600倍）使用血球計數(shù)器確定血液樣品中PDV的濃度，并用無菌水（0.9%生理鹽水）以10倍稀釋比例制備100、10-1、10-2、10-3的PDV梯度稀釋液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 模擬創(chuàng)傷感染 使用昆蟲針穿刺蠶體，人為制造較小創(chuàng)傷接種病毒模擬蠶創(chuàng)傷感染。操作過程在無菌操作臺進行，為避免傷口感染細菌，穿刺前用75%的酒精消毒蠶體并晾干，穿刺節(jié)間膜處需拉伸充分晾干以避免殘留酒精對出芽型病毒粒子產(chǎn)生不良影響［1］。用0#昆蟲針粘取病毒液穿刺蠶第一、二腹足環(huán)節(jié)的節(jié)間膜，刺入深度約2 mm，每次穿刺后昆蟲針在酒精燈火焰上加熱滅菌備用。

1.4.3 穿刺感染半數(shù)致死濃度（LC50）測定 取兩廣二號正交5齡起蠶，每30頭為一區(qū)，置于4.4 L （29.3 cm×19.3 cm×9.5 cm）塑料盒保鮮盒中飼養(yǎng)，分別穿刺接種以上制備的不同濃度病毒液，每種濃度3個重復(fù)，以無菌水作為空白對照。桂蠶N2正交的實驗方法同兩廣二號正交。試驗蠶在穿刺后72 h內(nèi)死亡，不計入有效感染死亡數(shù)，穿刺后72 h至168 h期間死亡及未上蔟的蠶均通過顯微鏡檢測確認感染病毒，計為有效感染死亡數(shù)，否則記為未感染蠶數(shù)。調(diào)查各區(qū)家蠶發(fā)生血液型膿病數(shù)量，采用Read-Muench法計算兩個蠶品種半數(shù)致死濃度（LC50）［5］。

1.4.4 BmNPV發(fā)病率計算方法

BmNPV發(fā)病率=（穿刺試驗累積平均發(fā)病數(shù)量-空白對照累積平均發(fā)病數(shù)量）/（30頭-72 h內(nèi)平均死亡數(shù)量-空白對照累積平均發(fā)病數(shù)量）×100%。

2 實驗結(jié)果

2.1 新鮮血液中家蠶核型多角體病毒含量

收集932×芙蓉添食NPV感染發(fā)病后的活蠶血液進行定量，確定血液中多角體個數(shù)為6.5×108個多角體/mL，然后按照10倍的稀釋梯度，制備PDV 4個濃度梯度，分別為6.5×108、6.5×107、6.5×106、6.5×105PDV/mL，用于穿刺試驗。

2.2 穿刺感染結(jié)果

使用0#昆蟲針穿刺5齡起蠶的第一、二腹足節(jié)間膜（圖1-A），且穿刺傷口將顯著大于腹足鉤爪單次造成的傷口（圖1-B），為降低外界細菌對實驗的干擾采取蠶體消毒處理，兩個蠶品種無菌水對照穿刺組均未見BmNPV發(fā)病前死亡蠶（72 h內(nèi)死亡，主要為細菌感染后敗血癥死亡），實驗重復(fù)性好。但兩個蠶品種接種病毒時均出現(xiàn)了發(fā)病前死亡現(xiàn)象，兩廣二號正交品種接種濃度由高至低平均每區(qū)分別為2.3頭、2頭、1.3頭、0頭，而桂蠶N2正交品種只有最高和次高兩個濃度接種時出現(xiàn)平均每區(qū)0.7頭、0.3頭死亡（表1），表現(xiàn)出了更好抵御細菌侵染的能力。使用SPAA19.0統(tǒng)計軟件One-wayANOVA進行顯著差異分析，兩個品種在相同濃度下差異達到顯著水平（P＜0.05），其中高濃度和次高濃度達極顯著差異（p＜0.01）。

圖1 家蠶體部結(jié)構(gòu)放大圖

2.3 半數(shù)致死濃度（LC50）測定試驗

統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示（表1），兩廣二號發(fā)病時間集中在96～120 h，而相同濃度接種情況下桂蠶N2的發(fā)病時間集中在120～144 h，較前者延遲24 h。累計發(fā)病情況，兩廣二號接種6.5×107PDV/mL以上濃度累計發(fā)病率已達100%，利用Read-Muench法計算得到半數(shù)致死濃度為2.46×106PDV/mL，相當于膿病發(fā)病末期活蠶血液稀釋264倍的病毒含量；同等實驗條件下桂蠶N2接種6.5×108PDV/mL濃度的病毒后累計發(fā)病率僅為62.9%，其半數(shù)致死濃度為2.21×108PDV/mL為膿病發(fā)病末期活蠶血液稀釋約3倍的值，即其抗病毒能力比兩廣二號高近90倍。試驗顯示桂蠶N2正交有很好抵御經(jīng)創(chuàng)傷感染核型多角體病毒的能力，可顯著減少蠶期創(chuàng)傷感染BmNPV的幾率。

表1 穿刺試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 討論

家蠶腹足底部有一定數(shù)量的鉤爪（圖1-C、圖1-D、圖1-E），若飼養(yǎng)密度大，蠶在爬行過程中容易相互抓傷皮膚，這一現(xiàn)象更容易發(fā)生在起蠶表皮還未完全硬化的階段。飼養(yǎng)密度高容易引起蠶體表創(chuàng)傷，增加感染NPV的幾率［3，4］，兩廣二號是常用的強健性蠶品種，在本試驗中顯示其外傷感染BmNPV的半數(shù)致死濃度為2.46×106PDV/mL，相當于實驗中取材的膿病末期活蠶血液稀釋264倍的值，屬于易感品種。桂蠶N2半致死濃度比兩廣二號高90倍，達2.21×108PDV/mL，使用病蠶血液原液（病毒含量為6.5×108PDV/mL）穿刺桂蠶N2的發(fā)病率只能達到62.9%，顯示其對BmNPV有很強的抑制或清除能力，具有更好的抗NPV病毒性狀。

實驗顯示穿刺濃度高時，出現(xiàn)少量非病毒病致死情況，癥狀為細菌性敗血病，同等條件下兩廣二號發(fā)生數(shù)量均顯著高于桂蠶N2，后者抗細菌感染呈現(xiàn)出整體好于前者的趨勢。值得注意的是桂蠶N2不僅有較強的抗核型多角體病毒能力，而且對細菌感染也有一定的抗性，這種多抗現(xiàn)象也曾有學(xué)者報道過，如張元能等［6］研究發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)品種越五、鈦金均具備抗多種病原微生物的能力。

核型多角體病毒在血體腔內(nèi)有兩種時相，細胞釋放型病毒（cell-released virus，CRV）和多角體衍生病毒粒子（polyhedron-derived virus，PDV），由于病毒大小的差異，對它們的定量方式也存在很大不同。CRV病毒粒子太小，定量PCR是常用的檢測手段，缺點是步驟繁瑣、耗時長且定量準確性一般；而PDV因其有多角體蛋白包裹保護，形態(tài)較大可在常規(guī)顯微鏡下直接觀察和定量，操作方便定量迅速。本文采用對其中一種病毒粒子定量間接評估兩種病毒粒子總量的定量策略，即使用顯微鏡（600倍）對PDV定量來評估病毒粒子總量（PDV+CRV），方法操作簡便，且實驗重現(xiàn)度高，能滿足本實驗需求。但這一方法也有一定的弊端，即幾乎僅在血體腔有強傳染能力的CRV［1，7］，未計入實驗數(shù)據(jù)，導(dǎo)致所測的半致死濃度數(shù)值應(yīng)比實際值低。

試驗為減小細菌對試驗重復(fù)性的影響，本文選擇BmNPV感染發(fā)病但未死亡或破裂膿病末期病蠶的血液進行穿刺，其病毒粒子的含量會低于正常發(fā)病死亡膿蠶所釋放的血液中病毒含量且細菌含量會升高，因此在實際養(yǎng)蠶過程中，膿蠶體液釋放后通過創(chuàng)傷造成的BmNPV二次感染的值會比本文試驗數(shù)值高。

桂蠶N2抗BmNPV創(chuàng)傷感染及抑制細菌感染的能力得以驗證，能有效降低血液型膿病的感染發(fā)病率，這一結(jié)果與目前桂蠶N2品種推廣應(yīng)用的實際情況相似［8］，在高溫季節(jié)血液型膿病發(fā)病率比兩廣二號低11.53個百分點，死籠率也低很多。由此可見，桂蠶N2對BmNPV食下、創(chuàng)傷兩個感染途徑均具有很強抵抗力，是很好的實用性抗病品種。大力推廣桂蠶N2將能顯著減少蠶期感染BmNPV的幾率，對控制新、老蠶區(qū)血液型膿病的爆發(fā)，提高蠶農(nóng)收益有積極的意義。

［1］ 呂鴻聲.昆蟲病毒分子生物學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社.1998：149-151.

［2］ 石美寧，閉立輝，顧家棟，等.家蠶抗血液型膿病新品種桂蠶N2的選育［J］.廣西蠶業(yè).2012，49（4）：1-12.

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［4］ 邱洪海.廣西家蠶血液型膿病及生物藥物防治的研究［D］.南寧：廣西大學(xué).2008

［5］ 浙江大學(xué).家蠶病理學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：242.

［6］ 張遠能，劉仕賢，霍用梅，等.若干家蠶品種對六種主要蠶病的抗性鑒定［J］.蠶業(yè)科學(xué).1982，8：94-97.

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［8］ 石美寧，唐亮，黃紅燕，等.桑蠶新品種“桂蠶N2”的推廣應(yīng)用初報［J］.廣西蠶業(yè).2015，52（3）：27-31.

S884；

A；

1006-1657（2016）03-0017-4

2016-05-18；

2016-06-05

信息］唐 亮（1984—），男，研究生，農(nóng)藝師，現(xiàn)從事家蠶抗病育種與病蟲害防控技術(shù)研究工作。E-mail：ty008tl@163.com