家蠶微孢子蟲與其他蠶病病原的聯(lián)合感染試驗

黃旭華，潘志新，黃深惠，王霞，唐亮，安春梅，胡文娟

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市 530007）

家蠶微孢子蟲與其他蠶病病原的聯(lián)合感染試驗

黃旭華，潘志新，黃深惠，王霞，唐亮，安春梅，胡文娟

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市 530007）

調(diào)查家蠶微孢子蟲（Nosema bomycis，簡稱Nb）分別與家蠶核型多角體病毒（BmNPV）、家蠶質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）、家蠶腸道菌、蘇蕓金桿菌（Bt）和家蠶白僵菌聯(lián)合感染家蠶時存在的拮抗情況。結(jié)果顯示家蠶感染適量Nb后，再以其它病原感染家蠶，都具有一定的降低家蠶微粒子病發(fā)生效果，其中以Nb感染家蠶后再感染BmNPV 或BmCPV的抑制效果較明顯，但其他病原或其他感染方式對降低家蠶微粒子病發(fā)生的效果不明顯。

家蠶微孢子蟲；蠶病病原；交叉感染；拮抗作用

在微生物界，兩種微生物間具有拮抗或增效作用是常見的現(xiàn)象，如常見研究報道一些芽孢桿菌可以分泌一些抗菌物質(zhì)抑殺其他細(xì)菌或真菌病原[1]。在蠶業(yè)界，也有些學(xué)者調(diào)查家蠶病原間的拮抗效果，如魯興萌等[2]的研究表明家蠶腸球菌對微孢子蟲體外發(fā)芽有明顯的抑制作用；肖仕全等[3]研究4種家蠶病原微生物（CPV、NPV、Nb、SCM6）交叉感染家蠶的致病力變化情況，發(fā)現(xiàn)Nb與CPV、SCM6交叉感染具有死亡率降低現(xiàn)象；劉廣生等[4]調(diào)查蘇云金桿菌與核型多角體病毒聯(lián)合致病的效果，發(fā)現(xiàn)Bt和BmNPV可以互相增強(qiáng)毒力的效果。家蠶微粒子病是一種危害性極大的蠶病，該病具有食下傳染和胚種傳染兩種傳染方式，是蠶種生產(chǎn)唯一的法定檢疫對象，家蠶微粒子病的防治是蠶業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵問題之一。家蠶微孢子蟲（Nosema bomycis，簡稱Nb）是家蠶微粒子病的典型病原，在蠶體內(nèi)Nb與其他病原的拮抗作用如何，本文進(jìn)行一些初步研究。

1 材料與方法

1.1 蠶品種

932×芙蓉（由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站提供）。

1.2 病原

家蠶微孢子蟲（Nosema bomycis，簡稱Nb）、家蠶核型多角體病毒（BmNPV）、家蠶質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）、蘇蕓金桿菌（Bt）、家蠶腸道菌和白僵菌均由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站蠶病研究室提供。Nb、BmNPV和BmCPV接種蠶體復(fù)壯、純化；Bt和腸道菌接種于LB固體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)12 h，用接種環(huán)挑取單菌落溶于無菌水配成菌體懸浮液；白僵菌接種于PDA固體培養(yǎng)基，于25℃培養(yǎng)72 h，利用無菌水把菌苔刮下，過濾，配成菌體原液。將各種試驗病原制成水玻片，在光學(xué)顯微鏡（×600）下觀察各種病原的形狀、大小等，用血球計數(shù)板測定各種病原懸浮液的濃度。

1.3 各種病原感染力測定

1.3.1 Nb半數(shù)感染濃度（IC50）測定 將家蠶微孢子蟲（Nb）孢子液稀釋成107～103個/ mL的10倍系列稀釋液，分別取各級濃度的微孢子蟲孢子液0.4 mL，涂抹于3張面積為12 cm2的桑葉上，飼喂1小區(qū)（30頭）2齡起蠶，重復(fù)3小區(qū)。待蠶兒吃凈帶毒葉后，改飼正常無毒桑葉，飼養(yǎng)至5齡起蠶，放置1d后對試驗區(qū)的每一頭蠶逐一研磨鏡檢，調(diào)查感染率。采用Reed-Muench法計算出其半數(shù)感染濃度（IC50）[5]。

1.3.2 BmNPV半數(shù)致死濃度（LC50）測定 攻毒方式同1.3.1，調(diào)查方式是添毒96 h后調(diào)查發(fā)病蠶頭數(shù)，連續(xù)調(diào)查4 d。采用Reed-Muench法計算出其半數(shù)致死濃度（LC50）。

1.3.3 BmCPV半數(shù)致死濃度（LC50）測定 攻毒方式同1.3.1，調(diào)查方式是添毒240 h后，逐頭研磨鏡檢，觀察是否有四角形多角體，調(diào)查發(fā)病蠶頭數(shù)。采用Reed-Muench法計算出其半數(shù)致死濃度（LC50）。

1.3.4 Bt 半數(shù)致死濃度（LC50）測定 攻毒方式同1.3.1，調(diào)查方式是添食病原后，即逐日調(diào)查卒倒病斃死病蠶頭數(shù)。采用Reed-Muench法計算出其半數(shù)致死濃度（LC50）。

1.3.5 腸道菌半數(shù)感染濃度（IC50）測定 將家蠶腸道菌液稀釋成109～107個/ mL的10倍系列稀釋液，攻毒方式同1.3.1，調(diào)查方式是添食病原24 h后，即觀察蠶兒發(fā)育情況，記錄斃死病蠶頭數(shù)。

1.3.6 白僵菌半數(shù)致死濃度（LC50）測定 采取浸葉片添食法進(jìn)行攻毒，操作方式同1.3.1，飼養(yǎng)溫度25±1℃，相對濕度90%。連續(xù)觀察14 d，并統(tǒng)計各處理的家蠶14 d累計死亡率及白僵蠶率。采用Reed-Muench法計算出其半數(shù)致死濃度（LC50）。

1.4 各種病原與Nb交叉感染試驗

1.4.1 BmNPV與Nb交叉感染 （1）以半數(shù)感染濃度（IC50）的Nb懸浮液0.4 mL涂抹于3張面積為12 cm2的桑葉上，飼喂1小區(qū)（30頭）2齡起蠶（12 h），再以半數(shù)致死濃度（LC50）二分之一的BmNPV懸浮液0.4 mL涂抹3張面積為12 cm2的桑葉飼喂家蠶（12 h），重復(fù)2區(qū)，然后再常規(guī)飼養(yǎng)至5齡起蠶，放置1 d后對試驗區(qū)的每一頭蠶逐一研磨鏡檢，調(diào)查家蠶微粒子病發(fā)病率；同時以無菌水涂抹桑葉飼喂的蠶區(qū)作為陰性對照，以2齡起蠶單獨(dú)感染Nb的蠶區(qū)做毒對照，即Nb對照（1）。

（2）取Nb與BmNPV混合感染，使混合液中的兩種病原濃度分別為NbIC50和BmNPVLC50二分之一，以病原混合懸浮液0.4 mL涂抹于3張面積為12 cm2的桑葉上，飼喂1小區(qū)（30頭）2齡起蠶（12 h），再常規(guī)飼養(yǎng)至5齡起蠶，調(diào)查家蠶微粒子病發(fā)病率；同時以無菌水涂抹桑葉飼喂的蠶區(qū)作為陰性對照，以2齡起蠶單獨(dú)感染Nb的蠶區(qū)做毒對照，即Nb對照（1）。

（3）以半數(shù)致死濃度（LC50）二分之一的BmNPV懸浮液0.4 mL涂抹于3張面積分別為12 cm2的桑葉上，飼喂1小區(qū)（30頭）2齡起蠶（12 h），再以半數(shù)感染濃度（IC50）的Nb懸浮液0.4 mL涂抹3張面積分別為12 cm2的桑葉飼喂家蠶（12 h），重復(fù)2區(qū)，然后常規(guī)飼養(yǎng)至5齡起蠶，放置1 d后對試驗區(qū)的每一頭蠶逐一研磨鏡檢，調(diào)查家蠶微粒子病發(fā)病率，同時以無菌水涂抹桑葉飼喂的蠶區(qū)作為陰性對照，以2齡蠶第二餐單獨(dú)感染Nb的蠶區(qū)做毒對照，即Nb對照（2）。

1.4.2 BmCPV與Nb交叉感染 攻毒方式和調(diào)查方式同1.4.1。

1.4.3 Bt 與Nb交叉感染 攻毒方式和調(diào)查方式同1.4.1。

1.4.4 腸道菌與Nb交叉感染 攻毒方式和調(diào)查方式同1.4.1，以5.6×109mL-1濃度的腸道菌懸浮液進(jìn)行攻毒。

1.4.5 白僵菌與Nb交叉感染 攻毒方式和調(diào)查方式同1.4.1。

2 試驗結(jié)果

2.1 Nb對家蠶半數(shù)感染濃度（IC50）

采用家蠶微孢子蟲（Nb）孢子懸浮液不同濃度（108～103個/ mL的10倍系列稀釋液）感染家蠶，測定出Nb對家蠶半數(shù)感染濃度（IC50）為5.65×104mL-1（見表1），顯現(xiàn)出Nb對家蠶具有較強(qiáng)感染力。

2.2 BmNPV 對家蠶半數(shù)致死濃度（LC50）

采用家蠶核型多角體病毒（BmNPV）懸浮液不同濃度（108～103個/ mL的10倍系列稀釋液）感染家蠶，測定出BmNPV對家蠶半數(shù)致死濃度（LC50）為1.61×106mL-1（見表1）。家蠶感染BmNPV后，高濃度感染處理區(qū)內(nèi)大部分蠶體已經(jīng)未能正常入眠，在96 h后出現(xiàn)蠶兒體皮破裂，流出乳白色膿液，之后死亡。因此，BmNPV對家蠶顯現(xiàn)出急性癥狀，具有較強(qiáng)感染力。

2.3 BmCPV 對家蠶半數(shù)致死濃度（LC50）

采用家蠶質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）懸浮液不同濃度（108～103個/ mL的10倍系列稀釋液）感染家蠶，測定出BmCPV對家蠶半數(shù)致死濃度（LC50）為5.12×105mL-1（見表1）。BmCPV感染家蠶（2齡）后，到3齡后期就開始出現(xiàn)食欲減退、發(fā)育不齊等癥狀，到4齡期群體發(fā)育大小懸殊，蠶體瘦小，常呆伏于蠶座四周或殘桑中，個別蠶排出的糞便有乳白色的黏液；到4齡后期陸續(xù)有死蠶，基本不能進(jìn)入4齡眠。因此，BmCPV對家蠶屬于慢性蠶病，根據(jù)LC50也說明其具有較強(qiáng)感染力。

2.4 Bt對家蠶半數(shù)致死濃度（LC50）

采用蘇蕓金桿菌（Bt）懸浮液不同濃度（108～103個/ mL的10倍系列稀釋液）感染家蠶，測定出Bt對家蠶半數(shù)致死濃度（LC50）為4.56×104mL-1（見表1）。利用Bt懸浮液感染家蠶后，高濃度區(qū)立即出現(xiàn)蠶兒突然停止食桑，蠶體痙攣并吐液，之后死亡；在低濃度區(qū)逐步出現(xiàn)部分蠶兒食欲減退，排不正形糞，行動呆滯，少部分有吐液情況，倒臥而死；在低濃度區(qū)也出現(xiàn)部分蠶兒食欲減退后又能恢復(fù)食桑，發(fā)育逐步正常的蠶兒。因此，Bt感染是一種急性蠶病，根據(jù)LC50也說明其具有較強(qiáng)感染力。

2.5 家蠶腸道菌對家蠶的感染情況

采用家蠶腸球菌懸浮液不同濃度感染家蠶，在高濃度感染區(qū)（108mL-1、109mL-1）發(fā)現(xiàn)當(dāng)齡蠶兒即表現(xiàn)出食欲減退、生長緩慢、發(fā)育不齊等現(xiàn)象；到下一齡（3齡）還出現(xiàn)個別偏小蠶死亡，但其它蠶兒出現(xiàn)食欲增加，生長加速的現(xiàn)象；在低濃度感染區(qū)（105mL-1、106mL-1）蠶兒未出現(xiàn)發(fā)病癥狀。因此，家蠶腸道菌對家蠶屬于慢性致病性，而且感染力較低，以至于無法測定出其半數(shù)感染濃度。

2.6 白僵菌對家蠶半數(shù)致死濃度（LC50）

采用家蠶白僵菌分生孢子懸浮液不同濃度（108～103個/ mL的10倍系列稀釋液）感染家蠶，測定出白僵菌對家蠶半數(shù)致死濃度（LC50）為1.32×106mL-1（見表1）。家蠶感染白僵菌病原后，高濃度感染處理區(qū)內(nèi)第3 d即出現(xiàn)病死蠶，發(fā)病初期蠶兒反應(yīng)遲鈍，之后蠶體伸直死亡，逐漸發(fā)硬，經(jīng)1～2 d尸體上長出白色菌絲。因此，白僵菌對家蠶具有急性致病性，根據(jù)LC50也說明其具有較強(qiáng)感染力。

表1 各種病原對家蠶的食下傳染力調(diào)查

2.7 Nb與BmNPV聯(lián)合感染結(jié)果

采取使家蠶先感染BmNPV再感染Nb或同時感染NPV與Nb或先感染Nb再感染BmNPV的3種方式調(diào)查BmNPV對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制效果。如表2，發(fā)現(xiàn)先感染BmNPV再感染Nb和先感染Nb再感染BmNPV的試驗方式有降低家蠶微粒子病發(fā)生率的情況，兩者抑制率分別為9.54%和22.72%，而BmNPV與Nb同時感染方式?jīng)]有抑制效果。因此，先感染Nb再感染BmNPV的試驗方式抑制效果顯著。在Nb與BmNPV交叉感染后，有部分蠶兒發(fā)生血液型膿病死亡。

2.8 Nb與BmCPV聯(lián)合感染結(jié)果

采用同2.7三種方式調(diào)查BmCPV對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制效果。如表2，發(fā)現(xiàn)先感染BmCPV再感染Nb或同時感染BmCPV與Nb方式對家蠶微粒子病發(fā)生沒有抑制效果，而先感染Nb再感染BmCPV的方式抑制率達(dá)到18.18%，抑制效果顯著。在兩者交叉感染后期，有部分蠶兒發(fā)生中腸型膿病死亡。

表2 Nb與BmNPV和BmCPV的交叉感染的效果

2.9 Nb與Bt聯(lián)合感染結(jié)果

采用同2.7三種方式調(diào)查Bt對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制效果。如表3，發(fā)現(xiàn)先感染Bt再感染Nb和先感染Nb再感染Bt的交叉感染方式對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制率分別為2.27%和6.67%；而同時感染NPV與Nb的方面沒有抑制效果。因此，Bt對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制效果不顯著。在兩種病原交叉感染后，有部分蠶兒有中毒癥狀死亡。

2.10 Nb與腸道菌聯(lián)合感染結(jié)果

采用同2.7三種方式調(diào)查家蠶腸道菌對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制效果。如表3，發(fā)現(xiàn)三種感染方式使腸道菌對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制率分別為4.54%、2.22%和8.89%，抑制效果均不顯著。因此，家蠶腸道菌對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制效果較差。

表3 Nb與Bt和腸道菌的交叉感染的效果

2.11 Nb與白僵菌聯(lián)合感染結(jié)果

采用同2.7三種方式調(diào)查家蠶白僵菌對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制效果。如表4，發(fā)現(xiàn)三種感染方式使白僵菌對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制率分別為0、2.22%和8.89%，抑制效果均不顯著。因此，家蠶白僵菌對家蠶微粒子病發(fā)生的抑制效果較差。在兩者交叉感染后，有部分蠶兒發(fā)生白僵病死亡。

表4 Nb與白僵菌交叉感染的效果

3 討論

眾多研究表明兩種病原微生物聯(lián)合感染寄主會互相影響感染力[1]。在蠶業(yè)生產(chǎn)中也廣泛存在病原微生物對家蠶的混合感染的現(xiàn)象[3]，而且在蠶種生產(chǎn)中還經(jīng)常發(fā)現(xiàn)發(fā)生其它病害后蠶種檢疫毒率有偏低的現(xiàn)象。本文調(diào)查了家蠶微孢子蟲（Nb）分別與BmNPV、BmCPV、家蠶腸道菌、蘇蕓金桿菌（Bt）和家蠶白僵菌交叉感染家蠶后微粒子病發(fā)生抑制情況，發(fā)現(xiàn)5種病原與Nb交叉感染后都存在降低家蠶微粒子病發(fā)生的效果，而且以Nb感染家蠶后再感染BmNPV 或BmCPV的方式抑制效果較明顯，其他病原（家蠶腸道菌、Bt和家蠶白僵菌）交叉感染也有降低微粒子病發(fā)生情況，但效果不明顯。

兩種病原微生物聯(lián)合感染寄主互相影響感染的機(jī)理可能有兩種情況：（1）某種病原可以分泌一些成分（如抗菌蛋白）殺滅或干擾另一種病原，使別的病原活力降低[6]；（2）某種病原感染寄主后使寄主組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，有利于另一種病原的浸染[7]。因此，兩種病原微生物聯(lián)合感染寄主會存在一些感染率變化的情況。另外，在某種病原單獨(dú)感染時，病原只需對抗宿主細(xì)胞的防御體系，而在交叉感染時，還要對抗其它病原的作用[3]，可能也是病原感染力變化的原因。

在本試驗中，BmNPV、BmCPV、家蠶腸道菌、蘇蕓金桿菌（Bt）和家蠶白僵菌與Nb交叉感染都或多或少有降低家蠶微粒子病發(fā)生的效果，是何種拮抗機(jī)理有待深入研究。另外，在其他各種病原與Nb交叉感染后都存在發(fā)生其它病原引起病害致死的情況，是否是兩種病原聯(lián)合感染后加速蠶兒死亡，從而降低微粒子病發(fā)生率。因此，病原微生物間聯(lián)合感染情況非常復(fù)雜，有待深入系統(tǒng)研究才能闡明原因，對此還需要進(jìn)一步的研究。

［1］ 朱麗云，戴賢君，張富明，等.枯草芽孢桿菌對畜禽常見致病微生物體外拮抗作用的研究［J］.動物生產(chǎn)，2009，45（21）：41-43

［2］ 魯興萌，汪方煒.家蠶腸球菌對微孢子蟲體外發(fā)芽的抑制作用［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2002，28（2）：126-128.

［3］ 肖仕全，潘敏慧，萬永繼，等.家蠶病原微生物的交叉感染研究［J］.蠶學(xué)通訊，2003，23（3）：1-5.

［4］ 劉廣生，牟志美，陳春花.蘇蕓金桿菌與核型多角體病毒對家蠶的聯(lián)合致病作用［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2005，31（2）：195-198.

［5］ 浙江大學(xué).家蠶病理學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：242.

［6］ 黃旭華，廖富蘋，林健榮，等.CP7菌株抗菌物質(zhì)對真菌的活性及其作用機(jī)制研究［J］.生物技術(shù)通報，2012（9）：125-130.

［7］ 于淑池，徐亞茹.拮抗細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)及拮抗機(jī)理研究進(jìn)展［J］.承德職業(yè)學(xué)院學(xué)報，2006（1）：67-69.

S884.21；

A；

1006-1657（2016）02-0016-4

2016-02-20；

2016-04-25

廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院青年基金項目（No.201213）。

信息］黃旭華（1979—），男，研究生，高級農(nóng)藝師，主要從事蠶病防治研究工作。E-mail：hgisoi@163.com