HPLC法測定復(fù)方雙花顆粒中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量

何遠(yuǎn)景 廖雪青

【摘要】目的：建立HPLC法測定復(fù)方雙花顆粒中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。方法：色譜柱為Welch -C18 柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-水（52∶48），流速為1.0ml/min，檢測波長： 穿心蓮內(nèi)酯為225nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯為254nm。結(jié)果：穿心蓮內(nèi)酯在2.55～51μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9999；脫水穿心蓮內(nèi)酯在2.662～53.24μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9999。穿心蓮內(nèi)酯平均回收率分別為97.9%，RSD=1.16%；脫水穿心蓮內(nèi)酯平均回收率100.13%、RSD= 1.86%。結(jié)論：此法重復(fù)性好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確，可作為該復(fù)方雙花顆粒質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

【關(guān)鍵詞】復(fù)方雙花顆粒；穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯；HPLC

【中圖分類號】R284.1【文獻標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）09-0030-02

復(fù)方雙花顆粒主要由金銀花，板藍根，連翹和穿心蓮四味藥組成，具有清熱解毒，利咽消腫的功效。其中，穿心蓮具有清熱解毒、涼血、消腫功效[1]，主要有效成分為穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯等二萜內(nèi)酯類成分。2010年版《中國藥典》一部“穿心蓮”藥材以穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的總量作為質(zhì)量控制指標(biāo)。研究復(fù)方雙花顆粒中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯兩者總含量的檢測方法，為其質(zhì)量控制提供實驗基礎(chǔ)。

1儀器與材料

1.1儀器島津 LC-2010CHT高效液相色譜儀（SPD-M20A檢測器，LC-Solution色譜工作站）；Waters 2695型高效液相色譜儀（Waters 2487檢測器，Waters -Solution色譜工作站）；BSA224S型電子分析天平；Sartorius CPA225D電子分析天平；數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2材料穿心蓮內(nèi)酯（批號：110854-200306）、脫水穿心蓮內(nèi)酯（批號：110797-200307）購于中國藥品生物制品檢定研究院；復(fù)方雙花顆粒 （批號：141201、141202、111102、111101）。

甲醇為色譜純（美國TEDIA公司）；水為超純水；其他所用試劑均為分析純。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Welch-C18柱（250×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（52∶48）；流速：1.0ml/min，檢測波長[2]： 穿心蓮內(nèi)酯為225nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯為254nm；柱溫：25℃；進樣量：20μl。理論塔板數(shù)按穿心蓮內(nèi)酯峰計不低于3000，脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計不低于2500。

2.2供試品溶液的制備取裝量差異下本品研細(xì)，取約1.0g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加甲醇25ml，稱定重量，90℃水浴加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10ml，加于中性氧化鋁柱（200～300目，5g，內(nèi)徑為1.5cm）上，用甲醇30ml洗脫，收集洗脫液，置于50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3線性關(guān)系考察精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對照品適量加甲醇超聲溶解，制成每1ml含2.55、5.1、10.2、12.75、25.5、51μg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；另精密稱取脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品適量加甲醇超聲溶解，制成每1ml含2.66、5.32、10.64、13.31、26.62、53.24μg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20μl，注入液相色譜儀，以對照品的濃度為橫坐標(biāo)，測得的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得穿心蓮內(nèi)酯回歸方程：Y=43662X+1753.3，r=0.9999，線性范圍為2.55～51μg；脫水穿心蓮內(nèi)酯回歸方程：Y=28283X-2757.8，r=0.9999，線性范圍為2.66～53.24μg。

2.4精密度試驗精密吸取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液進樣6次，進樣20μl，測定穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積，計算其RSD值，分別為0.2%、0.3%，表明儀器精密度良好。

2.5重復(fù)性試驗取批號為141201供試品6份，平行制成供試品溶液，測得穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯總含量為1.41 mg/g，RSD為1.50%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6回收率試驗取同一批已知含量（批號：141201，穿心蓮內(nèi)酯含量為0.959 mg/g，脫水穿心蓮內(nèi)酯含量為0.454 mg/g）樣品粉末0.5g，平行6份，分別精密加入穿心蓮內(nèi)酯（0.0204mg/g）和脫水穿心蓮內(nèi)酯（0.0106mg/g）混合對照品溶液25ml，同法制成加樣供試品溶液，測定并計算，穿心蓮內(nèi)酯平均回收率為97.9%，RSD為 1.16%；脫水穿心蓮內(nèi)酯平均回收率100.13%、RSD為 1.86%，表明回收率試驗良好。

2.7專屬性取處方中穿心蓮以外的藥材，按處方工藝，制得陰性對照溶液。按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果未見陰性對照溶液對試驗有干擾。

2.8穩(wěn)定性取同一份供試品溶液，分別在0、1、2、4、6、8、10h進樣測定并記錄其峰面積，結(jié)果不同時間點以穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的峰面積總和計，其RSD值為0.32%，表明供試品溶液在室溫放置10h內(nèi)具有比較好的穩(wěn)定性。

2.9耐用性分別比較了不同儀器（島津LC-2010CHT 和Waters2695高效液相色譜儀）和不同柱子（A：Welch Ultimate AHP-C18；B：Phenomenex-C18），結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.10樣品測定精密稱取4批樣品，每批樣品平行制備供試品溶液2份，進行測定，按外標(biāo)法計算穿心蓮內(nèi)酯（C20H30O5）和脫水穿心蓮內(nèi)酯（C20H28O4）總含量，結(jié)果四批樣品含量分別為8.53、8.57、4.97、5.05 mg/袋，平均值6.78 mg/袋。

3討論

3.1目前關(guān)于復(fù)方雙花顆粒的報道不多，且多數(shù)為金銀花中綠原酸的定量分析。因此，實驗選取了處方中穿心蓮進行定量分析研究。

3.2樣品處理方法的確定復(fù)方雙花顆粒樣品甲醇提取后色譜峰雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，為進一步純化，使用中性氧化鋁柱進行處理。結(jié)果表明，過中性氧化鋁柱后，穿心蓮內(nèi)酯峰附近雜質(zhì)峰明顯減少，分離度更好，脫水穿心蓮內(nèi)酯峰對稱性更好。

3.3使用中性氧化鋁柱柱處理前，先將柱內(nèi)的中性氧化鋁填充嚴(yán)實。洗脫液加入柱內(nèi)要使用玻棒引流，速度要慢，以免柱內(nèi)產(chǎn)生漩渦，影響洗脫劑的洗脫能力。

3.4穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯為結(jié)構(gòu)相近的酯類成分，二者之間容易相互轉(zhuǎn)化，因此選用雙波長測定，按二者的總含量計。4批樣品以穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量總和計，含量在4.97～8.57mg范圍內(nèi)，按最低含量4.97mg/袋的80%定標(biāo)準(zhǔn)限度為4.0mg/袋。綜上所述，擬規(guī)定含量限度為：每袋含穿心蓮以穿心蓮內(nèi)酯（C20H30O4）和脫水穿心蓮內(nèi)酯（C20H28O4）的總量計，不得少于4.0mg。

參考文獻

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志（65卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1982： 74-75.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：251-252.

（收稿日期：2016.03.08）