HPLC法測(cè)定藥食兩用植物刺梨中刺梨苷的含量

李齊激 南瑩 楊艷 王道平 楊小生

【摘要】目的：建立藥食兩用植物刺梨中刺梨苷的含量測(cè)定方法。方法：刺梨以75%乙醇水浴回流提取，采用Pntulips TM BP-C18（4.6 mm×250mm，5 μm）色譜柱，乙腈-0.05 %三氟醋酸溶液（27∶73）為流動(dòng)相，流速1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果：刺梨苷在0.23～2.3μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，平均回收率為97.82 %，RSD為2.44 %（n=6）。結(jié)論：利用HPLC建立了藥食兩用植物刺梨中刺梨苷的含量測(cè)定方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，為藥食兩用植物刺梨的合理開(kāi)發(fā)利用提供質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】刺梨；刺梨苷；HPLC

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）09-0022-03

[JP+1]刺梨為薔薇科植物繅絲花Rose roxburghii Tratt的果實(shí)，廣泛分布于暖溫帶及亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要分布在四川、云南和貴州三省，其中又以貴州野生與栽培資源最為豐富[1-2]。刺梨具有消食健脾，收斂止瀉的功效，主要用于治療積食腹脹，泄瀉等疾病[3]。研究表明，三萜和黃酮類(lèi)成分為刺梨的主要活性物質(zhì)，并在增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化、健胃消食等方面均具有較好的活性[4-6]。作為藥食兩用植物，1994版、2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》和2004年衛(wèi)生部食品新資源品種17號(hào)公告先后收錄該品種，目前在食品、保健用品、醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但其質(zhì)量控制方法仍處于空白，尤其是在醫(yī)藥、保健用品應(yīng)用領(lǐng)域。課題組結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)的活性三萜類(lèi)成分[7]，選擇其中較具有代表性的活性三萜—刺梨苷進(jìn)行含量測(cè)定，旨在建立藥食兩用植物刺梨的質(zhì)量控制方法，為該植物藥材及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供品質(zhì)評(píng)價(jià)與檢測(cè)方法參考。[JP]

1儀器與材料

1.1儀器Agilent 1100高效液相色譜（含柱溫箱、可見(jiàn)-紫外檢測(cè)器、四元泵、在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；電子天平（Mettler Toledo，26115102-0）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；ZK-82A 型真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2材料刺梨苷對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)NMR、MS等光譜數(shù)據(jù)確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過(guò)HPLC純度檢測(cè)為98.91%；乙腈為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），三氟醋酸為分析純（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3藥材刺梨藥材于2014年8月采自貴州龍里縣，經(jīng)貴州大學(xué)安華明教授教授鑒定為薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghii Tratt的果實(shí)（刺梨），標(biāo)本憑證（201408003）保存于貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Pntulips TM BP-C18（4.6 mm×250mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05 %三氟醋酸溶液（27∶[KG-*3/5]73）；柱溫：25 ℃；流速：1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：208 nm；進(jìn)樣量：10μl。在此色譜條件下，理論板數(shù)按刺梨苷峰計(jì)算≥3 000，與其他峰分離度>1.5。色譜圖詳見(jiàn)圖1。

2.2對(duì)照品溶液的配置取刺梨苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 ml含0.23 mg的溶液，即得。

2.3供試品溶液的配置取刺梨粗粉（過(guò)三號(hào)篩）約5 g，精密稱(chēng)定，置于圓底燒瓶中，加75 %乙醇100 ml，水浴回流提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮近干，加適量蒸餾水溶解，再用乙酸乙酯萃取至無(wú)色，合并乙酸乙酯萃取層，減壓濃縮近干，立即加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至至100 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4線性關(guān)系考察精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μl，分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=270.71X+9.7049，R2=0.9998。結(jié)果表明，刺梨苷在0.23～2.3μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5[JP+1]精密度考察精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積RSD為1.38 % （n=6），表明儀器精密度良好。[JP]

2.6重復(fù)性試驗(yàn)稱(chēng)取同一批次（20150801）刺梨樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果峰面積RSD為1.91 %（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性考察取同一批次（20150801）刺梨供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積RSD為2.61 %（n=6），表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)稱(chēng)取已知含量的刺梨樣品（20150801）6份，每份約2.5 g，分別加入刺梨苷4.4 mg，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9樣品測(cè)定取不同批次刺梨樣品約5g，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液各2份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中刺梨苷的含量，結(jié)果3批樣品（20150801、20150802、2015080）中刺梨苷的含量分別為0.176、0.180、0.183 mg/g。

3討論

3.1檢測(cè)指標(biāo)的選擇刺梨總?cè)茷樵撝参锏闹饕钚猿煞?，在惡性腫瘤、糖尿病方面效果較好，具有較高的應(yīng)用價(jià)值和良好的應(yīng)用前景[7-9]。試驗(yàn)綜合考察了其中3種活

性三萜刺梨苷、野薔薇苷、arjunetin的色譜條件、含量高低和代表性，最終選擇了分離度較好，含量較高，且尤具代表性的刺梨苷作為質(zhì)量控制的檢測(cè)指標(biāo)。

3.2提取條件的考察通過(guò)比較超聲、索氏回流、冷浸及水浴回流提取，結(jié)果刺梨苷含量高低依次為水浴回流>索氏回流>冷浸>超聲。其次，還比較了甲醇、乙醇、水作為溶劑的提取效果，結(jié)果三者提取含量變化較小，水提取含量稍高但雜質(zhì)峰較多，且分離度較差，考慮到經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，確定選擇以乙醇為溶劑，最終通過(guò)單因素考察最終確定以75%乙醇進(jìn)行提取。最后，還比較了乙酸乙酯萃取次數(shù)對(duì)含量的影響，發(fā)現(xiàn)以水-乙酸乙酯體積比為1∶[KG-*3/5]2時(shí)重復(fù)萃取3次可萃取完全。

參考文獻(xiàn)

[1]中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志（37卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1998：452.

[2]貴州植物志編輯委員會(huì).貴州植物志（7卷）[M].貴陽(yáng)：貴州人民出版社，1982：223.

[3]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M].貴陽(yáng)：貴州科學(xué)技術(shù)出版社，2003：230

[4]戴支凱，余麗梅，楊小生，等.刺梨三萜化合物CL1體外抗人子宮內(nèi)膜腺癌作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（7）：1656-1658.

[5]秦晶晶，李齊激，薛琰，等.刺梨總?cè)铺崛》椒捌洇?葡萄糖苷酶抑制活性研究[J].食品工業(yè)科技，2014，10（33）：186-189.

[6]趙轉(zhuǎn)地，張愛(ài)華，洪峰.刺梨及其產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)及保健藥用價(jià)值研究進(jìn)展[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2007，24（1）：82-84.

[7]楊小生，馬琳，梁冰，等.刺梨果活性提取物及其制備方法、檢測(cè)方法和應(yīng)用[P].中國(guó)專(zhuān)利：ZL201110080922，2013-03-20.

[8]南瑩，李齊激，馬琳，等.紫外分光光度法測(cè)定刺梨總?cè)婆c總黃酮含量[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，35（6）：473-476.

[9]秦晶晶，李齊激，薛琰，等.刺梨總?cè)铺崛》椒捌洇?葡萄糖苷酶抑制活性研究[J].食品工業(yè)科技，2014，10（33）：186-189.

（收稿日期：2016.03.21）