胞二磷膽堿對大鼠彌漫性軸索損傷后神經(jīng)元保護(hù)作用的研究

楊 帆，鄧 璐

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，四川 瀘州 646000)

胞二磷膽堿對大鼠彌漫性軸索損傷后神經(jīng)元保護(hù)作用的研究

楊 帆，鄧 璐

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，四川 瀘州 646000)

目的 探討胞二磷膽堿對大鼠彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury，DAI)后腦細(xì)胞功能變化的影響，評估藥物的治療價值。方法 采用大鼠頭部瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置制備DAI模型，通過胞二磷膽堿及神經(jīng)元凋亡通路抑制劑辛伐他汀干預(yù)控制，對比觀察胞二磷膽堿對DAI大鼠神經(jīng)修復(fù)的作用，于術(shù)后24、48、72 h及7d提取腦組織標(biāo)本，western blot法檢測SDF-1和神經(jīng)元凋亡及死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)的表達(dá)變化，并檢測β-APP的表達(dá)來指示軸突的損傷程度，用免疫熒光染色指示RhOA和NOGO-A表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 DAI模型組24 h后均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞壞死和軸突變性等病理改變；大腦皮層RhOA、NOGO-A、SDF-1和DAPK1隨著DAI后時間的延長而增加，經(jīng)免疫熒光雙染色顯示兩者在腦內(nèi)的表達(dá)有顯著的同一性；胞二磷膽堿及辛伐他汀能明顯降低SDF-1和DAPK1的表達(dá)，胞二磷膽堿作用更加顯著。結(jié)論 胞二磷膽堿可明顯改善DAI后神經(jīng)功能并減輕軸突損傷。

彌漫性軸索損傷；胞二磷膽堿；RhOA；神經(jīng)元凋亡及死亡相關(guān)蛋白激酶1；神經(jīng)保護(hù)；顱腦損傷

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury，DAI)常見于交通事故，主要由于腦組織在顱腦旋轉(zhuǎn)加速度和/或角加速度所產(chǎn)生的內(nèi)部剪力作用下，發(fā)生廣泛白質(zhì)變性，微小出血，神經(jīng)軸索回縮等，常與其他顱腦損傷合并，死亡率高。典型表現(xiàn)為長時間意識障礙，臨床診斷較困難且預(yù)后差，因此，對于DAI治療的研究有重要意義。目前，已在動物模型、臨床患者中證實(shí)急性顱腦創(chuàng)傷后存在神經(jīng)元凋亡[1]以及損傷部位抑制性環(huán)境的存在和促進(jìn)性環(huán)境的缺失[2]，同時，各種炎癥因子所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在DAI發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用[3]。本研究旨在采用胞二磷膽堿(cytidine diphosphate choline，CDPC)干預(yù)大鼠，并通過頭顱瞬間機(jī)械旋轉(zhuǎn)損傷制作大鼠DAI模型[4]，通過免疫組化、western blot等方法測定DAI后藥物干預(yù)組與對照組腦組織中軸突生長抑制因子RhOA、勿動蛋白(NOGO-A)、炎癥因子:基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)、神經(jīng)元凋亡標(biāo)志物:淀粉樣肽前體蛋白抗體(amyloid precursor protein，β-APP)和神經(jīng)元凋亡及死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)的表達(dá)變化，評估胞CDPC在彌漫性軸索損傷后對神經(jīng)元的保護(hù)作用以及促進(jìn)軸突功能恢復(fù)的價值，為臨床治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 成年雄性SD大鼠，購自四川醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，共60只，體重(290±18)g。CDPC注射液(四川梓橦宮藥業(yè))，辛伐他汀(四川梓橦宮藥業(yè))，RhOA單抗(abcom，英國)，NOGO-A多抗(abcom，英國)，β-APP單抗(sigma，美國)，SDF-1單抗(sigma，美國)，DAPK1單抗(GenTex，美國)。

1.2 DAI模型制作及分組 采用大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置制作DAI模型。方法:大鼠經(jīng)100 g/L水合氯醛2.0 ml/kg淺麻醉后俯臥位頭部固定在裝置的旋轉(zhuǎn)平臺，調(diào)整軀干與平臺間夾角約30°，按動扳機(jī)，使其頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)90°，遇到阻擋后隨即又瞬間停止，重復(fù)打擊8次。大鼠根據(jù)干預(yù)不同分為正常組、對照組和辛伐他汀組各10只，CDPC組30只。正常組為未損傷正常大鼠，對照組DAI造模后不加干預(yù)處理，辛伐他汀組在DAI前每日用辛伐他汀(60 mg/kg)連續(xù)灌胃1周，CDPC組在DAI前用CDPC注射液顱內(nèi)注射(100 mg/kg)。術(shù)后辛伐他汀組每日用辛伐他汀灌胃(100 mg/kg)，CDPC組按每日顱內(nèi)注射劑量分為100 mg/kg組、150 mg/kg組和200 mg/kg組各10只，分別于DAI術(shù)后24、48、72 h收集腦組織標(biāo)本備檢。

1.3 western blot 檢測 取腦后，勻漿化，用RIPA提取總蛋白，蛋白-80 ℃保存。每孔取40 μg蛋白樣品，用SDSPAG凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，脫脂牛奶封閉2 h分別加一抗β-APP(1∶500)，SDF-1(1∶1000)和DAPK1(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。次日洗膜后滴加相應(yīng)的標(biāo)記二抗(1∶2000)，室溫孵育1 h化學(xué)發(fā)光法觀察顯影。

1.4 免疫熒光染色 腦組織標(biāo)本依次經(jīng)固定、漂洗、脫水并透明后石蠟包埋。每個標(biāo)本連續(xù)切5 μm厚腦切片，切片脫蠟水化后，微波加熱修復(fù)抗原；山羊血清室溫封閉30 min，分別滴加一抗RhOA(1:100)，NOGO-A(1:100)，避光孵育1 h后，加入對應(yīng)二抗，DAPI 液封片；熒光顯微鏡下觀察、分析、采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 CDPC抑制DAI后軸突生長抑制因子的生成

DAI造模后48 h，對照組中SDF-1、DAPK1表達(dá)量較正常組升高，說明DAI造模成功。每日用CDPC治療劑量(100 mg/kg)干預(yù)48 h后明顯抑制SDF-1、DAPK1的表達(dá)，辛伐他汀干預(yù)7 d后SDF-1表達(dá)水平也有較明顯的下降(圖1，圖2)。DAI術(shù)后每日分別用100、150和200 mg/kg劑量的CDPC干預(yù)大鼠，7 d后提取各自腦組織標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-APP含量隨藥物濃度升高出現(xiàn)梯度下降(圖3)。

2.2 RhOA/NOGO-A免疫熒光染色 選擇7 d后對照組和CDPC組腦組織作RhOA、NOGO-A免疫熒光雙染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種蛋白在軸索損傷部位表達(dá)有高度相關(guān)性，經(jīng)CDPC干預(yù)后抑制因子RhOA、NOGO-A較對照組明顯降低(圖4)。

圖1 SDF-1在各組腦組織中的表達(dá)情況

圖2 DAPK1在各組腦組織中的表達(dá)情況

圖3 不同CDPC濃度干預(yù)7d后β-APP在各組腦組織中的表達(dá)情況

圖4 RhOA/NOGO-A免疫熒光雙染色(×400)

3 討論

CDPC又名胞嘧啶核苷二磷酸膽堿，是腦代謝激活劑，能夠保護(hù)神經(jīng)元及神經(jīng)髓鞘參與受損中樞神經(jīng)的修復(fù)和再生，促進(jìn)腦細(xì)胞呼吸，改善腦功能[5]。近年來有研究報道中性粒細(xì)胞浸潤在彌漫性軸索損傷中發(fā)揮著重要作用[6]。因此，探索DAI后藥物治療與外周炎癥細(xì)胞浸潤的相互聯(lián)系具有重要意義，本實(shí)驗(yàn)中CDPC顯著抑制DAI后損傷部位炎癥趨化因子的生成，從而有效抑制炎癥反應(yīng)對局部腦組織損傷，對照組大鼠DAI后48 h腦組織中SDF-1表達(dá)明顯升高，但通過CDPC干預(yù)其含量顯著降低，表明CDPC能有效控制損傷腦組織炎癥浸潤因子的生成，辛伐他汀干預(yù)效果不如CDPC明顯。同樣的效應(yīng)機(jī)制也體現(xiàn)在DAPK1檢測結(jié)果中，DAPK1可通過多種途徑介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的死亡，與對照組和辛伐他汀組比較，CDPC對DAPK1分泌表現(xiàn)出很強(qiáng)抑制作用。β-APP由β淀粉樣前體蛋白水解而來，在細(xì)胞基質(zhì)沉淀聚積后具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用，與神經(jīng)元的變性和凋亡關(guān)系密切[7]。我們分別用三種不同劑量CDPC干預(yù)大鼠，檢測β-APP，發(fā)現(xiàn)7d后β-APP含量隨藥物濃度升高出現(xiàn)梯度下降。研究發(fā)現(xiàn)，RhOA是軸突生長的抑制因子，在DAI發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[8]，我們通過熒光雙染色檢測RhOA與其下游蛋白NOGO-A表達(dá)的空間位置關(guān)系，結(jié)果顯示兩種蛋白在軸索損傷部位表達(dá)有高度相關(guān)性，經(jīng)CDPC干預(yù)后RhOA、NOGO-A較對照組明顯降低。

綜上所述，神經(jīng)細(xì)胞功能激活劑CDPC在大鼠彌漫性軸索損傷后可以有效保護(hù)神經(jīng)元功能，調(diào)控炎癥因子及神經(jīng)細(xì)胞抑制因子生成，有利于受損中樞神經(jīng)的修復(fù)和再生，改善腦功能。

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The effect of cytidine diphosphate choline on neuroprotection following diffuse axonal injury in rats

YANG fan，DENG Lu

(Department of Emergency medicine，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China)

DENGLu

Objective To investigate the effect of cytidine diphosphate cholineon neuroprotection following diffuse axonal injuryso as to evaluate the therapeutic effect. Methods The DAI model was prepared by using a coronal rotation device，and the brain tissue was obtained at 24 h，48 h and 72 h after DAI. The effect of neuroprotection of cytidine diphosphate and neuronal apoptosissignaling pathway inhibitor simvastatin was observed contrastively，The expression of SDF-1 and DAPK1 was detected by western blot，and the expression of β-APP as an indicater for the severity of axonal injury. The immunofluorescence double staining was used to observe the correlation of NOGO-A and RhOA expression.Results There were pathologic changes in the rats at 24 h after DAI such as neuronal death and axonal disruption.The expression of RhOA，SDF-1，NOGO-A and DAPK1 were in the consistent trend in that all of them increased with prolonged time duration and were significantly increased in cerebral cortex at 24 h，48 h，72 h and 7d after DAI compared with that in the control group.The expression of β-APP was also significantly increased at 24 h，48 h，72 h and 7d after DAI compared with that in the control group.On the contrary，after the administration of cytidine diphosphate choline and simvastatin，the level of RhOA，SDF-1，NOGO-A and DAPK1were also markedly decreased in the cytidine diphosphate choline and simvastatin group compared with those in DAI group，further more the cytidine diphosphate cholinegroup has a more obvious suppression.Conclusion The cytidine diphosphate choline can significantly improve the neurological function and repress the axonaldisruptionafter DAI.

Diffuse axonal injury；Cytidine diphosphate choline；RhOA；DAPK1；Neuroprotection；Traumaticbraininjury

R651.1；R917

A

1672-6170(2016)02-0063-03

2015-09-01；

2015-12-24)