天麻成分對羥基苯甲醛抗炎作用及機(jī)制研究

劉珊珊　向　彬　郭營營　蔣　石　淤澤溥　李秀芳

云南中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，云南　昆明　650500

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天麻成分對羥基苯甲醛抗炎作用及機(jī)制研究

劉珊珊向彬郭營營蔣石淤澤溥李秀芳*

云南中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，云南昆明650500

【摘要】目的：觀察天麻成分對羥基苯甲醛的抗炎作用，并探討其作用機(jī)制。方法：采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹方法及棉球植入致小鼠肉芽腫模型考察對羥基苯甲醛的抗炎作用，采用足跖注射花生四烯酸或角叉菜膠致大鼠足爪腫脹模型探討對羥基苯甲醛的抗炎作用特點。結(jié)果：對羥基苯甲醛對二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓炎癥反應(yīng)及棉球植入導(dǎo)致的小鼠肉芽腫形成具有顯著的抑制作用，對足跖注射花生四烯酸所致大鼠足爪腫脹模型有抑制作用，平均抑制率可達(dá)到31.7%，但對注射角叉菜膠引起的大鼠足爪腫脹無明顯作用。結(jié)論：天麻酚性成分對羥基苯甲醛具有顯著的抗炎作用，對炎癥急性時相及慢性增殖時相均有抑制作用，其抗炎機(jī)制與抑制花生四烯酸代謝的5-脂氧合酶途徑有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】天麻；對羥基苯甲醛；抗炎

天麻(GastrodiaelataBlume.)是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有平肝熄風(fēng)的功效，《本草匯言》中記載“天麻主頭風(fēng)，頭痛……一切中風(fēng)，風(fēng)痰”，現(xiàn)代臨床將天麻及其復(fù)方制劑用于高血壓[1-2]、缺血性腦血管疾病[3]的治療，取得了較好的療效。實驗研究表明，天麻及其復(fù)方制劑對高血壓或缺血性腦血管病的作用機(jī)制涉及了松弛血管平滑肌、抗腦缺血/再灌注損傷等。對羥基苯甲醛(p- Hydroxybenzaldehyde，PHBA)是天麻腦保護(hù)作用的重要活性成分之一，前期課題組已證實，PHBA具有抗腦血栓形成及抗血小板聚集[4]等作用。在課題組的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，PHBA還具有一定的抗炎活性，本文將對其抗炎作用的研究結(jié)果報道如下。

1材料

1.1藥物對羥基苯甲醛(PHBA，L760N29)，純度>99%，購自北京百靈威科技有限公司；角叉菜膠(117H0151)、阿司匹林(129K5400V)購自美國sigma公司；花生四烯酸(Arachidonic Acid，AA，A0781)，購自日本TCI公司；地塞米松(SA0419GA13)購自上海源葉生物科技有限公司，其它化學(xué)試劑購自天津化學(xué)試劑有限公司。1.2動物昆明種小鼠，清潔級，雌雄各半，體重18～22g，批號：Dossy-2011-03；雄性(Sprague Dawley, SD)大鼠，清潔級，體重250～300g，生產(chǎn)批號：Dossy-2011-01，所有動物均由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動物研究所提供，飼養(yǎng)條件：室溫為(22±2)℃，相對濕度60%～70%。

1.3細(xì)胞BV-2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞單層生長達(dá)到80%左右時進(jìn)行傳代。

1.4儀器酶標(biāo)儀(Infinite M200 PRO)，瑞士Tecan公司；足趾容積測量儀(YLS-7A)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；電子分析天平(AB204-S)，瑞士Mettler toledo公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo scientific公司；生物安全柜(BSC-1300II A2)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；倒置相差顯微鏡(Ti-S)，日本尼康。

2方法

2.1天麻成分PHBA對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響取昆明種小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為模型組(1%吐溫-80灌胃)，阿司匹林組， PHBA 高、低劑量組，灌胃給藥三天，末次給藥1h后，在小鼠右耳耳廓涂上二甲苯50μl致炎，40min后脫頸椎處死，剪下雙耳，用直徑為8mm的不銹鋼沖子沖下左、右兩耳耳片，分析天平上稱重。腫脹率%=(右耳重量-左耳重量)/右耳重量×100%，腫脹抑制率%=(模型組平均腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%，以腫脹率及腫脹抑制率作為反映藥物的抗炎作用強(qiáng)度的指標(biāo)。

2.2天麻成分PHBA對棉球植入導(dǎo)致小鼠肉芽腫形成的影響取昆明種小鼠40只，雌雄各半，所有動物均以0.3%戊巴比妥鈉30mg·kg-1腹腔注射麻醉，在無菌條件下，剪開腹部皮膚，將(10±2)mg的無菌棉球植入小鼠右側(cè)腹股溝，縫合，傷口涂抹青霉素，于手術(shù)后第2天，小鼠隨機(jī)分4組，每組10只，分別為溶媒組(1%吐溫-80)，陽性對照組(地塞米松)，PHBA高、低劑量組，每組動物按分組灌胃給予相應(yīng)藥物，1次·d-1，連續(xù)7次，末次給藥后1h，小鼠脫頸椎處死，取出棉球，稱濕重，置于60℃烘箱12h，稱干重，濕重-干重即得含水量，干重-棉球重即得肉芽干重。

2.3天麻成分PHBA對不同炎癥誘導(dǎo)劑致大鼠足趾腫脹模型的影響取SD大鼠64只，雌雄各半，隨機(jī)分為兩個大組，即注射AA組和注射角叉菜膠組，每個大組又分為4個小組，每小組8只，分別為模型組(1%吐溫-80灌胃)，地塞米松組，PHBA高、低劑量組，灌胃給藥2h后大鼠足趾分別注射1mg·ml-1AA或1%角叉菜膠0.1ml致炎，炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度以大鼠足趾腫脹體積作為評估指標(biāo)，大鼠足趾腫脹體積以左后爪體積減右后爪體積計算。注射后1h、2h、3h、4h各時間點將大鼠鼠爪浸入足趾溶劑測量儀的液體中，保持每次浸入的深度一致。根據(jù)液平面高度的增加值，溶劑測量儀將其自動轉(zhuǎn)化為體積值。不同藥物對鼠爪水腫的抑制率按下面公式計算。

3統(tǒng)計學(xué)方法

4實驗結(jié)果

4.1天麻成分PHBA對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響結(jié)果顯示，PHBA高劑量(30mg·kg-1)能顯著的抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓炎癥反應(yīng)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表1。

表1　天麻成分PHBA對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 ±s，n=10)

注：與模型組相比：*P<0.01，**P<0.01。

4.2天麻成分PHBA對棉球植入導(dǎo)致小鼠肉芽腫形成的影響結(jié)果顯示，天麻成分PHBA可顯著抑制棉球植入引起的小鼠肉芽增殖，并減少肉芽組織水分含量，詳見表2。

表2天麻成分PHBA對棉球植入導(dǎo)致小鼠肉

芽腫形成的影響

組別劑量/mg·kg-1肉芽組織干重/mg水分含量/mg模型組1%tween-8038.43±10.68 139.34±30.37 地塞米松211.70±0.47**55.00±8.75**天麻成分PHBA3021.38±9.44**104.81±29.56**1531.01±16.50 128.60±37.83

注：與模型組相比：*P<0.01，**P<0.01

4.3天麻成分PHBA對不同炎癥誘導(dǎo)劑致大鼠足趾腫脹模型的影響

4.3.1大鼠足趾注射AA或角叉菜膠致足趾腫脹模型的復(fù)制結(jié)果顯示，大鼠足趾注射AA可誘導(dǎo)強(qiáng)烈持續(xù)的鼠爪水腫，注射后大鼠左后爪比右后爪明顯腫脹，鼠爪皮膚發(fā)紫；大鼠皮下注射角叉菜膠也可導(dǎo)致鼠爪明顯腫脹，左后爪比右后爪顯著腫脹，皮膚顏色基本正常，詳見表3。

表3　AA和角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足趾腫脹模型的復(fù)制 ±s, n=8)

注：注射AA組 與 注射Na2CO3組相比，#P<0.05，##P<0.01；注射角叉菜膠組與注射生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01

4.3.2天麻成分PHBA對不同炎癥誘導(dǎo)劑致大鼠足趾腫脹模型的影響結(jié)果顯示，大鼠灌胃給予PHBA后2h，足趾注射角叉菜膠，在觀察的4h內(nèi)，PHBA對大鼠足趾腫脹無明顯抑制作用；而灌胃給予PHBA后2h，足趾注射AA，PHBA高劑量(20mg/kg)在1h及2h時可顯著減輕大鼠足趾水腫，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表4、5。

表4　天麻成分PHBA對角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹體積的影響　±s, n=8)

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

表5　天麻成分PHBA對AA誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹體積的影響　±s, n=8)

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

5討論

大量研究證據(jù)表明，腦缺血后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是造成繼發(fā)性腦神經(jīng)損傷的重要原因之一[5]，減輕炎癥反應(yīng)可能是擴(kuò)大腦缺血治療時間窗的有效途徑[6]。有文獻(xiàn)報道,天麻[7]及其有效成分對羥基苯甲醇具有減輕炎癥反應(yīng)作用，

而天麻的另一重要活性成分對羥基苯甲醛(PHBA)的抗炎作用報道較少。本研究的結(jié)果顯示，PHBA對炎癥急性期的水腫滲出及慢性期的肉芽組織增殖均有明顯的抑制作用，為初步探討其抗炎作用的途徑，我們復(fù)制了角叉菜膠和花生四烯酸(AA)這兩種炎癥誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹模型，據(jù)文獻(xiàn)報道，這兩種不同的誘導(dǎo)劑對AA代謝的環(huán)氧合酶(COX)途徑和5-脂氧合酶(5-LO)途徑具有相對的選擇性，大鼠足趾皮下注射AA主要是通過5-LO代謝途徑生成LTS導(dǎo)致鼠爪水腫，因此，該動物模型對5-LO的抑制劑具有相對的選擇性[8]，而皮下注射角叉菜膠則主要是引起COX途徑的激活，局部皮膚中產(chǎn)生大量的前列腺素類物質(zhì)，并與血管活性物質(zhì)和激肽類一起誘導(dǎo)鼠爪水腫，該動物模型對COX的抑制劑具有相對的選擇性[9]。PHBA對AA誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹具有顯著的抑制作用，而對角叉菜膠誘導(dǎo)的足趾腫脹作用不明顯，提示PHBA可能是通過抑制AA代謝的5-LO途徑發(fā)揮抗炎作用。深入的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳新宇，尹玲瓏，劉紫軒，等. 半夏白術(shù)天麻湯治療原發(fā)性高血壓臨床療效Meta分析[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41(2)：196-199.

[2] 周倩儀，馬楷奇，郭意欣，等.天麻鉤藤飲聯(lián)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療原發(fā)性高血壓的Meta分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21(4)：206-212.

[3] 許兆玉，李燕梅，劉洪峰，等.天麻鉤藤飲加減治療中風(fēng)先兆臨床研究[J].中醫(yī)學(xué)報，2012，27(171)：997-998.

[4] 李秀芳，代蓉，李國花，等.天麻成分對羥基苯甲醛抗血小板聚集作用及急性毒性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25(3)：317-320.

[5] Dénes, Ferenczi S, Kovács KJ.Systemic inflammatory challenges compromise survival after experimental stroke via augmenting brain inflammation, blood- brain barrier damage and brain oedema independently of infarct size[J].Journal of neuroinflammation, 2011，8： 164-175.

[6] Grnberg NV, Johansen FF, Kristiansen U, et al. Leukocyte infiltration in experimental stroke[J].J Neuroinflammation.2013,10:115-123

[7] Sun MH, Yun JL, Dae GK, et al. Anti-inflammatory effect of Gastrodia elata rhizome in human umbilical vein endothelial cells[J].The American Journal of Chinese Medicine,2009,37(2):395-406

[8] Pichat P, Angel I, Arbilla S, et al. Anti-inflammatory properties of mizolastine after oral administration on arachidonic acid-induced cutaneous reaction in the rat[J]. Drug Res, 1998,48(2):173-178.

[9] Pinheiro RM, Calixto JB. Effect of the selective COX-2 inhibitors, celecoxib and rofecoxib in rat acute models of inflammation [J]. Inflammation Res, 2002,51(12)：603-610.

Study of Anti-inflammation of p- Hydroxybenzaldehyde fromGastrodiaelataBlume

XIANG BinLIU ShanshanGUO YingyingYU ZepuLI Xiufang*

Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China

Abstract:Objective To study the anti-inflammation of p- Hydroxybenzaldehyde(PHBA) from Gastrodia elata Blume. Method The mice models of ear swelling and cotton ball granuloma were established to observe the effects of PHBA on ear swelling, the granuloma weight. Rat model of paw-swelling induced by arachidonic acid(AA) or carrageenan were used to investigate the anti-inflammatory characteristic of PHBA. Result PHBA could significantly reduce the xylene induced ear swelling in mice. It also decreased granuloma weight and water content in mice. PHBA could significantly reduce paw swelling degree induced by AA but not by carrageenan. Conclusion The results suggest that PHBA has strong anti-inflammation effect. It could suppress not only the acute or chronic nonspecific inflammation reaction but also specific inflammation of AA induced rat paw-swelling and LPS-induced microglia activation, which might be closely related to inhibit the 5-LO enzymes in AA metabolism pathway .

Key words:Gastrodia elata Blume; p- Hydroxybenzaldehyde; anti-inflammation

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目，No.81303263，No. 81560664；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究-中醫(yī)聯(lián)合專項，No. 2015FB205(-019)。

作者簡介：劉姍姍，碩士研究生，主要從事中藥學(xué)(中藥藥理研究與應(yīng)用)研究,E-mail:15198905376@163.com通信作者：李秀芳，副教授，主要從事中藥藥理與毒理研究，E-mail:sofinelxf@163.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)09-0016-03

(收稿日期：2016.03.30)