人IgE-Fc結構域的基因克隆、原核表達及單克隆抗體的制備

崔璐璐，畢嘉成，李俊鑫，劉綠艷，葉秀峰，鄭明星，萬曉春，于廣

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人IgE-Fc結構域的基因克隆、原核表達及單克隆抗體的制備

崔璐璐，畢嘉成，李俊鑫，劉綠艷，葉秀峰，鄭明星，萬曉春，于廣

【摘要】

目的通過制備小鼠抗人 IgE 單克隆抗體，為過敏性疾病的研究及診斷打下基礎。

方法以 CRL8033 細胞的 cDNA 為模板擴增人 IgE Fcε3-4 段基因序列并將其連接到 pET-32a（+） 載體中，轉化BL21（DE3）大腸桿菌并進行表達。然后將表達所得包涵體進行變復性，把復性所得蛋白進行親和純化，通過 SDS-PAGE驗證純化效果。最后將純化的蛋白作為抗原免疫 BALB/c小鼠，經(jīng)三次免疫后取小鼠脾臟細胞與 SP2/0 細胞融合。用 ELISA 法篩選出能結合人 IgE 蛋白的陽性克隆，并應用 ELISA、Western blot 等手段對雜交瘤所分泌單克隆抗體的特異性進行鑒定。

結果成功構建 pET-32a（+）-IgE Fcε3-4 載體并純化 IgE Fcε3-4 蛋白。用該蛋白作為免疫原免疫小鼠，成功制備了雜交瘤細胞株，其分泌的單克隆抗體能夠特異性結合人 IgE蛋白，可用于 ELISA、Western blot 等手段對人 IgE 的檢測。

結論成功獲得了可用于特異性檢測人 IgE 蛋白的單克隆抗體，為人 IgE 的檢測及哮喘等過敏性疾病的研究、診斷及治療奠定了基礎。

【關鍵詞】免疫球蛋白 E；抗體，單克隆；過敏性疾病

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術, 2016, 11(3):242-246

作者單位：121001 遼寧，錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院（崔璐璐、于廣）；518055 深圳，中國科學院深圳先進技術研究院（畢嘉成、李俊鑫、劉綠艷、萬曉春）；518035 深圳，廣東省深圳市第二人民醫(yī)院呼吸科（葉秀峰、鄭明星）

IgE 在哮喘等過敏性疾病中發(fā)揮重要作用［1］，它由 B 細胞分泌［2］，通過與嗜酸性粒細胞［3］和肥大細胞［4］表面的 Fc 受體結合，導致其脫顆粒釋放炎性介質，從而引起過敏癥狀。IgE 在健康人的血清中是含量最少的一種免疫球蛋白［5］，但它在過敏患者血清中的含量與患病程度及預后密切相關［6］，因而 IgE 含量的檢測對哮喘等過敏性疾病的診斷、治療及發(fā)病機制研究具有重要意義［7-8］。本研究旨在制備能特異性識別人 IgE 的單克隆抗體，為人 IgE的檢測及哮喘等過敏性疾病的研究、診斷及治療奠定基礎。

1　材料與方法

1.1主要材料

擴增 IgE Fcε3-4 所用的 CRL8033 細胞由上海張江生物技術公司饋贈。DNA 及蛋白分子量標準、質粒小提及膠回收試劑盒購于北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；pET32a（+）、BL21（DE3） 及 SP2/0細胞由本實驗室保存；載體構建過程中使用的限制性內切酶、聚合酶均購自日本 Takara 公司；T4 連接酶購自美國 Thermo 公司。弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、PEG4000、HAT 及亞型鑒定試劑盒為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；小鼠抗人 CTLA4 單克隆抗體由本實驗室制備；細胞培養(yǎng)使用的 DMEM、FBS、青霉素-鏈霉素等試劑均為美國 Hyclone 公司產(chǎn)品；人全長 IgE 蛋白及商品化小鼠抗人 IgE單克隆抗體（B3102E8）購自美國 Abcam 公司；人 IgG 蛋白購自美國 Proteintech 公司。

1.2方法

1.2.1pET-32a（+）-IgE Fcε3-4 載體構建以 CRL8033 細胞 cDNA 為模板，擴增目的序列 IgE Fcε3-4。上游引物為：CCGGAATTCTCTGGGTACA CCCCAGGGACT（標記處為 EcoR I），下游引物為：CCGCTCGAGATGGACTGCACGGCAGATGAACT（標記處為 XhO I）。擴增條件：變性 94 ℃ 30 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1 min，共 35 個循環(huán)，最后再次延伸 2 min。將擴出片段膠回收后插入pET32a（+） 載體中，轉化 DH5α 感受態(tài)細胞。陽性克隆經(jīng) Invitrogen 公司測序、比對 Genbank 數(shù)據(jù)驗證為正確序列。

1.2.2IgE Fcε3-4 蛋白的原核表達將測序正確的菌液進行質粒提取并轉化 BL21（DE3） 感受態(tài)細胞，通過菌液 PCR 鑒定陽性克隆。擴大培養(yǎng)正確菌液于 900 ml LB 培養(yǎng)基中（含有終濃度為50 μg/ml 的氨芐青霉素），于 37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)至 A600= 0.6 ～ 0.8，加入 IPTG 使其終濃度為 0.2 mmol/L，繼續(xù)誘導培養(yǎng) 3 h 后收菌。

超聲破碎菌體后 4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，向離心所得沉淀中加入 20 ml 包涵體裂解液并將其置入 4 ℃ 冰箱中旋轉過夜裂解。次日取出后，4 ℃、12 000 r/min 離心 30 min。將離心所得上清液轉移到透析袋內，分別經(jīng) 8、4、2、1、0 mol/L尿素透析，除 2 mol/L 過夜透析外，其余梯度均每4 小時更換一次。每次更換梯度均向透析液內加入0.1 mmol/L 的 PMSF 5 ml 和 1 mol/L 的 DTT 1 ml。

透析結束后將透析袋中的蛋白轉移至離心管，4 ℃、12 000 r/min 離心 30 min。所得上清液即為IgE Fcε3-4 融合蛋白，再用鎳柱親和層析的方法對所得蛋白進一步純化。最后經(jīng) Bradford 蛋白定量、SDS-PAGE 蛋白電泳及 Western blot 驗證純化效果。

1.2.3小鼠免疫及血清抗體滴度測定用純化的IgE Fcε3-4 融合蛋白免疫 BALB/c 小鼠，共 6 只。第一次免疫用弗氏完全佐劑和蛋白 1∶1 等體積乳化，每只 100 μg 皮下多點注射。每間隔 2 周分別進行第 2 次和第 3 次免疫，后兩次免疫用弗氏不完全佐劑與抗原蛋白乳化，其余方法同第一次免疫。第 3 次免疫后采血，用間接 ELISA 方法測定血清抗體滴度，具體步驟如下：用純化的 IgE Fcε3-4融合蛋白包被 ELISA 板，12.5 ng/孔，4 ℃ 包被過夜；PBST 洗板 3 遍后加脫脂奶粉 180 μl/孔，37 ℃ 封閉 3 h；PBST 洗板 3 遍，加梯度稀釋的血清，37 ℃ 孵育 1 h；洗板后加 HRP 標記的山羊抗小鼠 IgG 抗體，100 μl/孔，37 ℃ 孵育 30 min；最后一次洗板后加 TMB 避光顯色 10 min，用2 mol/L 的濃硫酸終止反應，在酶標儀上檢測OD450值。

1.2.4單克隆抗體制備第 3 次免疫后選取滴度高的小鼠進行加強免疫，3 d 后將小鼠脾臟細胞與 SP2/0 細胞采用 PEG 法進行細胞融合。通過HAT 加壓篩選、ELISA 及 Western blot 篩選得到陽性克隆并對其進行亞克隆。將獲得的雜交瘤細胞接種到 BALB/c 小鼠腹腔，再經(jīng)腹水純化即可得到抗人 IgE 抗體。

1.2.5抗體亞型鑒定用人全長 IgE 包被ELISA 板，37 ℃ 孵育 3 h。PBST 洗板 3 遍后加5% 的脫脂奶粉，37 ℃ 封閉 1 h。PBST 洗板后加入雜交瘤上清液，室溫孵育 3 h。再次洗板后加入山羊抗小鼠 IgG1、山羊抗小鼠 IgG2a、山羊抗小鼠 IgG2b、山羊抗小鼠 IgM、山羊抗小鼠 IgA 抗體并在室溫孵育 30 min。同樣洗板后加 HRP 標記的驢抗山羊 IgG 抗體，室溫孵育 15 min。洗板后加 TMB 避光顯色 10 min，用 2 mol/L 的濃硫酸終止反應，在酶標儀上檢測 OD450值。

1.2.6抗體特異性檢測用 Western blot 來驗證自制抗人 IgE 抗體與 IgG 是否有交叉反應，用商品化的人 IgE 和 IgG 加蛋白 Loading Buffer 煮沸變性后進行蛋白電泳，轉膜后用 5% 脫脂奶粉封閉 1 h。一抗用雜交瘤上清，4 ℃ 孵育過夜，PBST 洗 3 遍。二抗是 HRP 標記的山羊抗小鼠抗體，室溫孵育 30 min，PBST 洗 3 遍，加 ECL 發(fā)光液曝光。

1.2.7ELISA 檢測不同抗體對人 IgE 識別的濃度依賴性分別用純化的抗人IgE單克隆抗體6A10和商品化的小鼠抗人IgE單克隆抗體（B3102E8）100 ng/孔包被 ELISA 板。常規(guī)封閉后，一抗用人全長 IgE 從 100 ng/孔作 4 倍梯度稀釋。其余步驟同前。

2　結果

2.1人 IgE 的 Fc 結構域的克隆表達策略

為了制備出特異性識別人 IgE 而不識別其他免疫球蛋白的單克隆抗體，免疫原使用人 IgE 所特有的結構域（圖1A）。以 CRL8033 細胞［9］的cDNA 為模板，PCR 克隆出對應序列的閱讀框DNA 片段，連接到 pET-32a（+） 原核表達載體并轉化 BL21（DE3） 表達菌。經(jīng) PCR（圖1B）及測序鑒定，獲得了帶有正確抗原序列閱讀框的表達菌株。

2.2人IgE的Fc結構域的蛋白表達、純化與鑒定

經(jīng) IPTG 誘導菌株表達抗原蛋白后，采用蛋白電泳鑒定其表達產(chǎn)物，結果顯示抗原蛋白主要以包涵體的形式存在（圖2A）。包涵體經(jīng)過變復性后通過鎳柱親和層析純化。蛋白電泳（圖2B）及 Western blot（圖2C）結果表明抗原蛋白被成功純化。

B：M：D2000 plus 分子量標準；1 ～ 6：IgE Fcε3-4 轉化子B： M： D2000 plus molecular weight standard； 1 - 6： IgE Fcε3-4 transformants圖1　人 IgE 的 Fc 結構域的克隆表達策略（A）和克隆轉化子的菌液 PCR 鑒定（B）Figure 1　Cloning and expression strategy of human IgE-Fc domain （A） and transformants was characterized by PCR （B）

A：IPTG 誘導人 IgE-Fc 表達電泳（M：蛋白分子量標準；1：重組載體沉淀；2：空載體沉淀；3：重組載體上清；4：空載體上清）；B：SDS-PAGE （M：蛋白分子量標準；1：抗原蛋白）；C：Western blot（M：蛋白分子量標準；1：Trx 融合蛋白；2：抗原蛋白）A： Protein electrophoresis of induced expression of human IgE-Fc domain by IPTG （M： Protein molecular weight standard； 1： Precipitants of transformants；2： Precipitants of control bacteria； 3： Supernatants of transformants； 4： Supernatants of control bacteria）； B： SDS-PAGE （M： Protein molecular weight standard；1： Antigen protein）； C： Western blot （M： Protein molecular weight standard； 1： Trx fusion protein； 2： Antigen protein）圖2　人 IgE 的 Fc 結構域的蛋白表達、純化與鑒定Figure 2　Protein expression， purification and characterization of the Fc domain of human IgE

圖3　抗人 IgE 的 Fc 結構域的單克隆抗體的制備［A：三次免疫后小鼠血清中抗人 IgE 抗體的滴度測定；1 ～ 6：免疫小鼠血清；7：對照小鼠血清（未免疫小鼠血清）；B：單克隆抗體 6A10 的抗體亞型測定］Figure 3　Preparation of monoclonal antibodies against human IgE-Fc domain （A： The titering of anti-human IgE antibody in the serum of mice after the third immunization； 1 - 6： Post-immunization serum； 7： Serum from control mouse； B： Determination of the subtype of monoclonal antibody 6A10）

圖4　抗體識別人 IgE 的特異性檢測結果［A：Western blot 檢測不同抗體識別人 IgE 或人 IgG 的信號強弱（一抗使用以下抗體，1：B3102E8；2：小鼠抗人 CTLA4 單克隆抗體；3：6A10）；B：抗體識別人 IgE 的信噪比（1：B3102E8；2：小鼠抗人 CTLA4 單克隆抗體；3：6A10）；C：ELISA 檢測不同抗體對人 IgE 識別的濃度依賴性］Figure 4　The specificity of mouse anti-human IgE monoclonal antibody ［A： Western blot detection of human IgE or human IgG antibodies （Primary antibodies used are as follows， 1： B3102E8； 2： Mouse anti-human CTLA4 monoclonal antibody； 3： 6A10）；B： Analysis of signal （bands of IgE） versus noise （bands of IgG） from the results of Western blot detection of human IgE in A （1：B3102E8； 2： Mouse anti-human CTLA4 monoclonal antibody； 3： 6A10）； C： 6A10 monoclonal antibody recognized human IgE by ELISA in a dose-dependent manner］

2.3抗人 IgE 的 Fc 結構域的單克隆抗體 6A10的制備

抗原對小鼠進行三次免疫后，小鼠體內產(chǎn)生了高滴度的抗體，同時對照小鼠的血清中沒有檢測到能識別抗原的抗體存在（圖3A），這表明使用大腸桿菌表達的抗原蛋白能夠在小鼠體內成功誘導出特異性識別人 IgE 的 B 細胞克隆。然后通過雜交瘤技術獲得了一系列雜交瘤細胞株，并通過 ELISA篩選得到了一株高抗體滴度的雜交瘤細胞株6A10。經(jīng)鑒定 6A10 所產(chǎn)生的單克隆抗體亞型為IgG2a（圖3B）。

2.4單克隆抗體 6A10 能特異性識別人 IgE 蛋白

為了鑒定 6A10 單克隆抗體識別人 IgE 的特異性，將 6A10 純化抗體與商品化的小鼠抗人 IgE抗體（B3102E8）及對照抗體作比較，觀察它們通過 Western blot 檢測人 IgE 及人 IgG 的信號強弱。結果顯示，6A10 單抗能以強烈的信號檢測到人 IgE 的存在，同時幾乎無法檢測出人 IgG（圖4A）。若以檢出人 IgE 的信號與檢出人 IgG 的信號作比值，可以發(fā)現(xiàn) 6A10 檢測人 IgE 的信噪比遠遠高于所測試的商品化小鼠抗人 IgE抗體（B3102E8）（圖4B）。表明 6A10 能高度識別人IgE 蛋白。此外，ELISA 結果顯示6A10 對人 IgE的識別還具有劑量依賴性（圖4C）。

3　討論

IgE 是過敏性疾病的重要效應分子，也是過敏性疾病的重要指標與治療靶點，因而開發(fā)出高度特異性的抗人 IgE 單克隆抗體，對于過敏性疾病的研究、診斷與治療均有重要意義。本研究通過將人IgE 蛋白的 Fc 結構域作為免疫原來免疫小鼠，借助雜交瘤技術最終獲得能夠分泌抗人 IgE 單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經(jīng)鑒定該雜交瘤分泌的單克隆抗體能高度特異地識別人 IgE。這種識別不僅具有劑量依賴性，而且對人 IgG 蛋白亦無交叉反應。因而可用 ELISA 及 Western blot 等方法在基礎研究和臨床診斷中對人 IgE 蛋白進行檢測。該單克隆抗體的開發(fā)，為過敏性疾病的研究、診斷與治療奠定了良好基礎。

參考文獻

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Author Affiliations: Jinzhou Medical University， Liaoning 121001， China （CUI Lu-lu， YU Guang）； Shenzhen Institutes of Advanced Technology， Chinses Academy of Sciences， Shenzhen 518055， China （BI Jia-cheng， LI Jun-xin， LIU Lü-yan， WAN Xiao-chun）；Shenzhen Second People's Hospital， Shenzhen 518035， China （YE Xiu-feng， ZHENG Ming-xing）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):242-246

Cloning， expression of human IgE-Fc and generation of mouse anti-human IgE monoclonal antibody

CUI Lu-lu， BI Jia-cheng， LI Jun-xin， LIU Lü-yan， YE Xiu-feng， ZHENG Ming-xing， WAN Xiao-chun， YU Guang

【Abstract】

ObjectiveThis work aims at preparation of mouse anti human IgE monoclonal antibody， for research and diagnosis of allergic diseases.

MethodsIn this study， we first amplified the gene of IgE Fcε3-4 from the cDNA of CRL8033 cell line and cloned into pET-32a（+）expression vector. This recombinant vector was transformed into BL21（DE3） E.coli and the recombinant protein expression was induced by IPTG. The antigen obtained from the inclusion body was renatured and was purified by Ni2+affinity chromatography. The purity of the protein was assessed by SDS-PAGE. Finally we used the purified protein as an antigen to immunize BABL/c mice and the spleen cells were fused with SP2/0 after the third immunization. The hybridomas secreting monoclonal antibodies that could recognize human IgE was identified by ELISA and Western blot.

ResultsWe successfully constructed the pET-32a（+）-IgE Fcε3-4 expression vector， purified the antigen from inclusion body， and used the purified protein as an antigen to immunize mice. Successfully prepared hybridoma cell lines secretes monoclonal antibodies capable of specifically recognize human IgE， which can be used for ELISA and Western blot to detect human IgE.

ConclusionWe successfully obtain a monoclonal antibody which can be used to specifically detect human IgE protein， laying the foundation for diagnosis and treatment of asthma and other allergic diseases.

【Key words】Immunoglobulin E；Antibodies， monoclonal；Allergy disease

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.008

基金項目：深圳市科創(chuàng)委基礎研究項目（JCYJ20130401113257009）；深圳市孔雀計劃團隊引進資助項目（1110140040347265）

通信作者：于廣，Email：ly65401@sina.cn；萬曉春，Email：xc.wan@ siat.ac.cn

收稿日期：2016-02-14

Corresponding Authors: YU Guang， Email： ly65401@sina.cn； WAN Xiao-chun， Email： xc.wan@siat.ac.cn