青春期大鼠髁突軟骨內(nèi)潤(rùn)滑素的表達(dá)研究

陳正　涂少勤　盧紅飛　麥志輝　陳琳　陳奇

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)部(陳正，盧紅飛，麥志輝，陳琳，陳奇)；518000佛山，廣東省佛山市口腔醫(yī)院正畸科(涂少勤)

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青春期大鼠髁突軟骨內(nèi)潤(rùn)滑素的表達(dá)研究

陳正涂少勤盧紅飛麥志輝陳琳陳奇

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)部(陳正，盧紅飛，麥志輝，陳琳，陳奇)；518000佛山，廣東省佛山市口腔醫(yī)院正畸科(涂少勤)

【摘要】目的研究無(wú)干預(yù)措施下青春期大鼠髁突軟骨內(nèi)潤(rùn)滑素的表達(dá)情況。方法選取5組5周齡的雌性SD大鼠(每組5只)，軟食喂養(yǎng)下分別于3、7、14、21和30 d處死，下頜骨髁突制作切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色及Envision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢查，應(yīng)用倒置相差光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微照相系統(tǒng)觀察和拍攝圖片，測(cè)量潤(rùn)滑素陽(yáng)性區(qū)域的累積光密度值，比較不同實(shí)驗(yàn)時(shí)點(diǎn)潤(rùn)滑素的表達(dá)情況。結(jié)果大鼠髁突軟骨細(xì)胞具有獨(dú)特的層域化分帶；髁突全層均有潤(rùn)滑素的表達(dá)，其中靜止層僅見(jiàn)少量潤(rùn)滑素表達(dá)；纖維層中，潤(rùn)滑素聚集在最表層細(xì)胞的細(xì)胞漿中；增殖層中，潤(rùn)滑素分布于整個(gè)軟骨細(xì)胞中；肥大層中，潤(rùn)滑素分布于肥大的軟骨陷窩內(nèi)細(xì)胞質(zhì)中，淺肥大層表達(dá)較強(qiáng)，靠近深肥大層逐漸減弱。在相同時(shí)點(diǎn)，髁突后部軟骨增殖層潤(rùn)滑素陽(yáng)性區(qū)域的累積光密度值均高于肥大層潤(rùn)滑素的累積光密度值(P均<0.05)；在不同時(shí)點(diǎn)，髁突后部增殖層和肥大層潤(rùn)滑素陽(yáng)性區(qū)域的平均累積光密度均無(wú)明顯變化(P均>0.05)。結(jié)論在青春期SD大鼠髁突軟骨中，潤(rùn)滑素表達(dá)水平呈現(xiàn)一定的連續(xù)性和穩(wěn)定性，這為髁突生理性改建、下頜骨正常發(fā)育提供了良好的內(nèi)環(huán)境。

【關(guān)鍵詞】青春期大鼠；髁突軟骨；潤(rùn)滑素

下頜骨發(fā)育不足是骨性Ⅱ類(lèi)錯(cuò)牙合畸形常見(jiàn)表現(xiàn)形式，作為人體骨骼系統(tǒng)的一部分，下頜骨的生長(zhǎng)速度在青春期達(dá)到高峰，此時(shí)若給予合適的導(dǎo)下頜向前的功能矯治，刺激髁突生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)下頜骨體量的增大是實(shí)現(xiàn)治療目標(biāo)的一種常見(jiàn)方式。髁突作為顳下頜關(guān)節(jié)的重要組成部分，受到關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的影響[1]。近期研究表明，潤(rùn)滑素在關(guān)節(jié)組織的正常生理功能中起到關(guān)鍵性的作用，其作為一種邊界潤(rùn)滑劑，不僅可改變關(guān)節(jié)滑液的流變學(xué)性能，釋放關(guān)節(jié)軟骨所受的機(jī)械負(fù)荷，還可直接影響關(guān)節(jié)軟骨的代謝、保護(hù)軟骨表面完整性，是實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)生理性改建的重要環(huán)節(jié)[2-3]。本研究通過(guò)檢測(cè)青春期SD大鼠髁突軟骨后部的潤(rùn)滑素表達(dá)情況，初步探討正常發(fā)育時(shí)髁突軟骨內(nèi)潤(rùn)滑素表達(dá)水平，旨在為后續(xù)闡明功能矯治下頜后縮機(jī)制提供參考依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取25只5周齡遠(yuǎn)交系Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，體質(zhì)量(100±5)g，由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物的處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則。

二、主要儀器與試劑

包括：日本OLYMPUS 1X71倒置相差光學(xué)顯微鏡及OLYMPUS光學(xué)顯微照相系統(tǒng)，格蘭仕微波爐，石蠟切片機(jī)，展片機(jī)，生物組織包埋機(jī)，電熱鼓風(fēng)干燥箱；兔抗?jié)櫥囟嗫寺】贵w(Abcam公司，英國(guó))，GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒[基因科技(上海)有限公司]。

三、方法

1. 實(shí)驗(yàn)分組

將25只5周齡SD雌性大鼠隨機(jī)分為5組(3、7、14、21和30 d)，每組5只。各組間小鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，軟食喂養(yǎng)，可自由飲水。

2. 組織準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別用軟食飼養(yǎng)3、7、14、21和30 d，用10%水合氯醛(按0.3 ml/100 g體質(zhì)量)腹腔麻醉后，經(jīng)心內(nèi)插管灌注生理鹽水后再灌注10%中性甲醛固定液(約300 ml)。切下動(dòng)物頭部，在同樣的固定液中浸泡過(guò)夜。沿頭部正中矢狀面切開(kāi)頭部成兩半后，分別在10%依地酸二鈉(EDTA，pH 7.4)室溫下脫鈣6～8周，每周換1次脫鈣液。脫鈣后去除顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)周?chē)慕M織，暴露大鼠下頜升支及髁突。常規(guī)脫水，包埋于石蠟中，平行于矢狀面切顳下頜關(guān)節(jié)成3 μm厚。選取石蠟切片平鋪于硅化玻片上，在60℃下恒溫2 h以確保組織能夠黏附到載玻片上，備用。

3. 蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色

常規(guī)將標(biāo)本脫蠟、水化、蘇木素-伊紅染色、封片。

采用Envision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)，標(biāo)本脫蠟、水化、將切片置于3%過(guò)氧化氫中，微波爐低火檔加熱3 min，以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用1∶50稀釋的EDTA修復(fù)液(pH 9.0)進(jìn)行抗原熱修復(fù)，磷酸鹽緩沖液沖洗后，滴加50 μl HRP二抗(Dako Envision復(fù)合物)，37℃濕盒孵育30 min，加二氨苯聯(lián)胺(DAB)溶液顯色液(按1∶50稀釋)，顯微鏡下觀察顯色，自來(lái)水中止顯色，用蘇木素溶液復(fù)染。人肝組織切片(來(lái)源于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科)按上述步驟進(jìn)行染色作為陽(yáng)性對(duì)照；顳下頜關(guān)節(jié)石蠟切片以磷酸鹽緩沖液代替一抗按上述步驟進(jìn)行染色作為陰性對(duì)照。

4. 觀察內(nèi)容及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，髁突軟骨后上部是髁突生長(zhǎng)以及引導(dǎo)下頜向前治療后發(fā)生改變最明顯的部位[4]。故本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)髁突后上部潤(rùn)滑素表達(dá)變化。

免疫組化染色的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：顯微鏡下觀察，潤(rùn)滑素陽(yáng)性區(qū)域定位于髁突軟骨細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色；人肝組織切片的細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色；陰性對(duì)照切片無(wú)棕黃色染色。應(yīng)用OLYMPUS 1X71倒置相差光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微照相系統(tǒng)觀察和放大40～400倍拍攝圖片，圖像使用Photoshop CS4圖像處理軟件，在平行于髁突軟骨細(xì)胞分層界線分別在髁突后上部的增殖層和肥大層隨機(jī)選擇3個(gè)350像素×100像素固定大小的區(qū)域，導(dǎo)入Image Pro-Plus軟件中測(cè)量潤(rùn)滑素陽(yáng)性區(qū)域的累積光密度值(IOD)。以陽(yáng)性區(qū)域IOD與圖片面積的比值作為指標(biāo)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、髁突軟骨的組織形態(tài)特點(diǎn)

髁突軟骨表面包繞一層纖維組織即關(guān)節(jié)盤(pán)，對(duì)應(yīng)于關(guān)節(jié)盤(pán)后帶略靠后部位的軟骨組織最厚，髁突軟骨由后向前逐漸變薄。髁突軟骨細(xì)胞具有獨(dú)特的層域化分帶，根據(jù)軟骨細(xì)胞形態(tài)，髁突由淺至深可分5層，分別為纖維層、靜止層、增殖層、肥大層和移行層，各層之間相互移行，見(jiàn)圖1、2。

圖1　青春期大鼠髁突軟骨組織的

A、M、P分別對(duì)應(yīng)髁突軟骨的前、中、后部

圖2　青春期大鼠髁突后部軟骨組織的

A、R、P、H、Z分別對(duì)應(yīng)髁突軟骨的纖維軟骨層、靜止層、增殖層、肥大層和移形層

二、髁突全層潤(rùn)滑素的表達(dá)情況

1. 鏡下觀察

青春期大鼠中，髁突的全層均有潤(rùn)滑素的表達(dá)，髁突后部表達(dá)明顯，在其靜止層僅見(jiàn)少量潤(rùn)滑素表達(dá)；在纖維層中，潤(rùn)滑素聚集在最表層細(xì)胞的細(xì)胞漿中，鏡下呈扁平狀，與髁突軟骨關(guān)節(jié)面平行；在髁突軟骨增殖層中，潤(rùn)滑素分布于整個(gè)軟骨細(xì)胞中；在髁突軟骨肥大層中，潤(rùn)滑素分布于肥大的軟骨陷窩內(nèi)細(xì)胞質(zhì)中，淺肥大層表達(dá)較強(qiáng)，靠近深肥大層逐漸減弱，見(jiàn)圖3、圖4。

圖3　青春期大鼠髁突軟骨組織的

A、M、P分別對(duì)應(yīng)髁突軟骨的前、中、后部

2. 定量分析

髁突后部各時(shí)點(diǎn)的軟骨增殖層潤(rùn)滑素陽(yáng)性區(qū)域的IOD分別高于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的肥大層潤(rùn)滑素IOD(P均<0.05)；髁突后部增殖層和肥大層潤(rùn)滑素陽(yáng)性區(qū)域的IOD在不同時(shí)點(diǎn)組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖5。

圖4　青春期大鼠髁突后部軟骨組織的病理切片(IHC染色，A×200,B、C×400)

A、R、P、H、Z分別為髁突軟骨的纖維軟骨層、靜止層、增殖層、肥大層和移形層，黑色箭頭所示為潤(rùn)滑陽(yáng)性表達(dá)；B、C分別為P、H層中黑色選框放大圖像

表1　增殖層和肥大層組內(nèi)、組間潤(rùn)滑素表達(dá)水平的比較±s,n=5)

圖5　青春期大鼠髁突后部軟骨潤(rùn)滑素表達(dá)水平的比較

增殖層和肥大層潤(rùn)滑素表達(dá)水平比較，*P<0.05

討論

骨性Ⅱ類(lèi)錯(cuò)牙合畸形常表現(xiàn)為上頜前突、下頜后縮的突面面型，其中下頜發(fā)育不足尤為明顯。對(duì)于此類(lèi)成年患者，臨床上通常采取正頜手術(shù)延長(zhǎng)下頜骨長(zhǎng)度，而對(duì)處于青春期或青春前期的患者，則采用引導(dǎo)下頜向前的功能矯治以刺激下頜骨的生長(zhǎng)發(fā)育，達(dá)到上、下頜骨骨量協(xié)調(diào)的目的。作為下頜骨的主要生長(zhǎng)區(qū)域以及顳下頜關(guān)節(jié)的重要組成部分，髁突的生長(zhǎng)改建與關(guān)節(jié)的負(fù)荷環(huán)境息息相關(guān)，而顳下頜關(guān)節(jié)是一種滑液關(guān)節(jié)，在正常咀嚼、言語(yǔ)等口腔正常功能運(yùn)動(dòng)時(shí)受到各種機(jī)械負(fù)荷。覆蓋于顳下頜關(guān)節(jié)表面的關(guān)節(jié)盤(pán)和關(guān)節(jié)軟骨以及關(guān)節(jié)腔內(nèi)的滑液可有效吸收和分散下頜功能運(yùn)動(dòng)中對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)造成的負(fù)荷。其中，良好的關(guān)節(jié)潤(rùn)滑機(jī)制是維持顳下頜關(guān)節(jié)正常功能運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)期健康的重要因素。作為關(guān)節(jié)潤(rùn)滑機(jī)制的重要組成部分，邊界潤(rùn)滑是指在關(guān)節(jié)負(fù)荷持續(xù)存在，關(guān)節(jié)軟骨的部分表面接觸時(shí)，由液膜潤(rùn)滑過(guò)渡到干摩擦(軟骨表面直接接觸)過(guò)程之前的臨界狀態(tài)，是關(guān)節(jié)潤(rùn)滑的最后階段[5]。軟骨表面的潤(rùn)滑素作為一種邊界潤(rùn)滑劑，具有潤(rùn)滑關(guān)節(jié)的作用，是關(guān)節(jié)邊界潤(rùn)滑的關(guān)鍵[6]。體內(nèi)和體外的研究均表明，潤(rùn)滑素可減小摩擦力，為關(guān)節(jié)滑液提供分散由于運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的應(yīng)變能的能力，具有保護(hù)關(guān)節(jié)作用[7]。Leonardi等[8]通過(guò)對(duì)無(wú)退行性變的人顳下頜關(guān)節(jié)組織切片研究發(fā)現(xiàn)，潤(rùn)滑素在顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)中間帶表層區(qū)域的表達(dá)量明顯高于中心區(qū)域，而且在關(guān)節(jié)盤(pán)中間帶中心區(qū)域的細(xì)胞周?chē)募?xì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)潤(rùn)滑素的表達(dá)。

本研究中，選取的SD大鼠屬于嚙齒類(lèi)動(dòng)物，其與人類(lèi)的顳下頜關(guān)節(jié)在組織結(jié)構(gòu)具有高度相似性，生長(zhǎng)周期較短，且較易獲得樣本量，是研究人顳下頜關(guān)節(jié)的理想動(dòng)物模型[9]。本研究時(shí)間為大鼠5～9周齡，這個(gè)時(shí)間段包含髁突快速生長(zhǎng)的階段，也覆蓋了SD大鼠的整個(gè)青春期，可代表臨床應(yīng)用功能矯治器的大部分患者年齡段。研究結(jié)果顯示，青春期SD大鼠髁突后部軟骨細(xì)胞質(zhì)中含有潤(rùn)滑素的表達(dá)，并且在整個(gè)青春期沒(méi)有明顯變化。本研究還發(fā)現(xiàn)，在髁突軟骨增殖層和肥大層軟骨細(xì)胞質(zhì)有潤(rùn)滑素表達(dá)，與Ohno等[10]關(guān)于潤(rùn)滑素在髁突軟骨的表達(dá)的研究結(jié)果相同。這提示，SD大鼠髁突軟骨中潤(rùn)滑素表達(dá)水平在青春期呈現(xiàn)一定的連續(xù)性和穩(wěn)定性，為顳下頜關(guān)節(jié)提供持續(xù)、有效的邊界潤(rùn)滑能力，可有效地減少顳下頜關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)過(guò)程的負(fù)荷，從而提供了顳下頜關(guān)節(jié)生長(zhǎng)、發(fā)育所需要的穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境。但是，潤(rùn)滑素在髁突軟骨增殖層和肥大層中表達(dá)的具體作用及機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究闡明。

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(本文編輯：林燕薇)

Study of the expression of lubricin in condylar cartilage of puberty rats

ChenZheng,TuShaoqin,LuHongfei,MaiZhihui,ChenLin,ChenQi.

DepartmentofStomatology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,ChinaCorrespondingauthor,ChenZheng,E-mail: 278467653@qq.com

【Abstract】ObjectiveTo detect the expression of lubricin in the condylar cartilage of the puberty rats without interventions. MethodsTwenty five 5-week-old female Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into five groups (n=5). The animals were fed with ground pellets and sacrificed on 3-, 7-, 14-,21-and 30-d. The mandibular condyle tissues were prepared for H.E and immunohistochemical staining. Under inverted optical microscope, integrated optical density (IOD) of the area of positive lubricin was quantitatively analyzed. The expression levels of lubricin were measured and compared at different time points. ResultsCondylar cartilages presented with varying characteristics among different layers. Lubricin was expressed throughout the whole condyle. Lubricin was slightly expressed in the static zone. In the articular fibrous zone, lubricin was abundant in the chondrocyte cytoplasm of the superficial layer. In the proliferative zone, lubricin was distributed throughout the condylar cartilages. In the hypertrophic zone, lubricin was observed in the cytoplasm of hypertropic cartilage lacuna, with higher expression in the superficial layer than the deep layer. At the same time point, IOD values of the positive lubricin area in the proliferative zone were significantly higher compared with those in the hypertrophic zone of the posterior mandibular condyle (all P<0.05). In both the proliferative and hypertrophic zones, no significant changes were documented in the IOD values at varying time points (all P>0.05). ConclusionIn the condylar cartilage of the puberty SD rats, lubricin was stably and continuously expressed, creating a sound inner environment for physiological reconstruction of mandibular condyle and normal growth of the mandible.

【Key words】Puberty rats; Condylar cartilage; Lubricin

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.05.010

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(201333)

(收稿日期：2016-01-18)

·基礎(chǔ)研究論著·

通訊作者，陳正，E-mail：278467653@qq.com