P16INK4A在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)及與HPV感染的關(guān)系

宋保志　劉佳華　高玉玲　孫　陽(yáng)　陳　政　石　紅

350001 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院

?

P16INK4A在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)及與HPV感染的關(guān)系

宋保志劉佳華高玉玲孫陽(yáng)陳政石紅

350001 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院

【摘要】目的探討抑癌基因P16INK4A在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)情況及其與HPV感染的相關(guān)性。方法采用免疫組化染色法，對(duì)59例宮頸上皮瘤變(CIN)標(biāo)本、30例病理檢查為正常宮頸組織的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果CIN Ⅰ級(jí)組織中ILK表達(dá)陽(yáng)性率62.50%、CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)為65.71%，均顯著高于正常宮頸組織(23.33%)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.472，P=0.004<0.05；χ2=11.675，P=0.001<0.05)；CIN Ⅰ級(jí)組織中ILK表達(dá)陽(yáng)性率與CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.064，P=0.800>0.05)。P16INK4A在HPV16、HPV18 2種高危型宮頸HPV感染中的表達(dá)顯著高于其他高危型或者低危型(HPV53、HPV58、HPV6)。結(jié)論P(yáng)16INK4A在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)中顯著高表達(dá)，同時(shí)P16INK4A高表達(dá)可能與HPV16、HPV18的陽(yáng)性表達(dá)具有協(xié)同作用。

【關(guān)鍵詞】P16INK4A；宮頸上皮內(nèi)瘤變；免疫組化；HPV

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:730～733)

宮頸癌近年來(lái)已嚴(yán)重威脅了女性的健康，有報(bào)道宮頸癌根治術(shù)術(shù)后五年生存率不足30%，而現(xiàn)階段有關(guān)宮頸癌的早期篩查以宮頸細(xì)胞學(xué)以及宮頸HPV病毒的篩查為主，鑒于不同檢測(cè)方式導(dǎo)致的HPV感染陰性而宮頸細(xì)胞學(xué)檢查出不典型性宮頸上皮內(nèi)病變的患者逐漸增加，而宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)同樣存在主觀性的特點(diǎn)，不同的檢驗(yàn)科醫(yī)生的判斷標(biāo)準(zhǔn)有所區(qū)別，故臨床上對(duì)于宮頸癌的早期輔助篩查需要其他指標(biāo)進(jìn)行輔助篩查[1-2]。而近年來(lái)P16INK4A作為抑癌基因，其編碼的蛋白能特異性地抑制CDK4的活性，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[3]。而部分學(xué)者認(rèn)為P16INK4A可能在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用，本研究通過(guò)探討59例宮頸上皮瘤變(CIN)標(biāo)本、30例病理檢查為正常宮頸組織中P16INK4A的表達(dá)來(lái)揭示其相應(yīng)的臨床價(jià)值，具體研究如下。

1材料與方法

1.1對(duì)象

納入標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸上皮瘤變組織標(biāo)本為本院手術(shù)切除的經(jīng)病理學(xué)明確診斷的標(biāo)本；②正常宮頸組織標(biāo)本為本院門(mén)診實(shí)施婦科檢查，取活組織經(jīng)病理檢查正常的標(biāo)本；③所有研究對(duì)象近期未接受激素類(lèi)等藥物治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①未進(jìn)行明確的病理學(xué)診斷的患者；②近期應(yīng)用抗病毒、激素類(lèi)藥物治療的患者。

選取本院收集的59例宮頸上皮瘤變(CIN)標(biāo)本、30例病理檢查為正常宮頸組織的標(biāo)本作為研究對(duì)象。CIN組標(biāo)本59例，其中CIN Ⅰ級(jí)24例、CIN Ⅱ級(jí)20例，CIN Ⅲ級(jí)15例，年齡30～70歲，平均年齡(49.24±10.67)歲；30例正常宮頸組織病例，年齡32～65歲，平均年齡(45.24±8.52)歲。兩組病例的平均年齡未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示兩組具有較好的可比性(P>0.05)。

1.2標(biāo)本采集

宮頸上皮內(nèi)瘤變標(biāo)本以及正常宮頸組織標(biāo)本均為本院婦科有經(jīng)驗(yàn)的宮頸領(lǐng)域?qū)＜也杉?，采集過(guò)程較為一致，其中宮頸上皮內(nèi)瘤變組織為我院婦科陰道鏡門(mén)診收治的CIN病變患者術(shù)中切除的部分宮頸病變組織，而正常宮頸組織為我院婦科門(mén)診超聲聚焦治療對(duì)于宮頸糜爛以及部分宮頸息肉患者術(shù)中切除的部分宮頸組織，所有患者均知曉本次研究并簽署相關(guān)知情同意書(shū)。標(biāo)本采集后統(tǒng)一放置4 ℃冰箱保存。

1.3檢測(cè)方法

應(yīng)用免疫組化技術(shù)，檢測(cè)P16INK4A在宮頸上皮內(nèi)瘤變以及正常宮頸組織中的表達(dá)，操作過(guò)程采用標(biāo)準(zhǔn)的石蠟切片法，P16INK4A相關(guān)一抗以及二抗均為南京凱基生物科技有限公司生產(chǎn)，二抗孵育后相關(guān)熒光的檢測(cè)采用熒光顯微鏡觀察(荷蘭phenom飛納高分辨率熒光顯微鏡)。mRNA水平的檢測(cè)采用組織研磨的方式提取RNA，并采用takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用takara公司的熒光定量PCR試劑盒定量擴(kuò)增P16INK4A基因，組間對(duì)比采用△△CT值對(duì)比。

1.4免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組織化學(xué)法的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，P16INK4A陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)黃色、棕黃色著色，按照著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)，共分為4級(jí)。0分：無(wú)色；淡黃色：1分；棕黃色：2分，褐色：3分；顯微鏡下染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：1%～25%：1分；26%～50%：2分；51%～75%：3分；>75%:4分；兩個(gè)得分項(xiàng)目相加為最終評(píng)分，(-)為總分<3分，陰性表達(dá)；(+)為3分，弱陽(yáng)性表達(dá)；(++)為4分，中度陽(yáng)性表達(dá)；(+++)為5分及以上，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1P16INK4A在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變中mRNA水平的表達(dá)(圖1)

結(jié)果提示：P16INK4A在宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中的表達(dá)異常發(fā)生率高于正常宮頸組織，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著宮頸上皮內(nèi)病變的發(fā)展，P16INK4A表達(dá)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖1　P16INK4A mRNA 在正常宮頸以及宮頸上皮內(nèi)瘤變

2.2免疫組化檢測(cè)結(jié)果

CIN Ⅰ級(jí)標(biāo)本患者中P16INK4A表達(dá)陽(yáng)性率為62.50%、CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)標(biāo)本患者中為65.71%，均顯著高于正常宮頸組織標(biāo)本的23.33%，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.472，P=0.004<0.05；χ2=11.675，P=0.001<0.05)；CIN Ⅰ級(jí)標(biāo)本患者的P16INK4A表達(dá)陽(yáng)性率與CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)標(biāo)本患者的陽(yáng)性表達(dá)率之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.064，P=0.800>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　不同類(lèi)型組織標(biāo)本中P16INK4A的表達(dá)情況/例

2.3P16INK4A在不同宮頸HPV亞型感染中的表達(dá)情況(圖2)

于陰道鏡檢查前3天(第1天)、陰道鏡檢查當(dāng)日(第4天)以及陰道鏡檢查后1周(第11天)，分別采用活檢鉗取部分宮頸上皮組織，檢測(cè)P16INK4A mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果提示在HPV16、HPV18宮頸病變組織中，P16INK4A表達(dá)水平顯著高于其他HPV高?；颊?P<0.05)，并顯著高于HPV低危宮頸組織中P16INK4A表達(dá)水平(P<0.05) 。

圖2　P16INK4A在不同宮頸HPV亞型感染中的表達(dá)情況

3討論

近年來(lái)雖然宮頸病毒學(xué)HPV以及宮頸細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于育齡期女性常規(guī)宮頸篩查，但鑒于不斷有臨床工作者報(bào)道發(fā)現(xiàn)不同數(shù)量的HPV陰性但宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性的病例，特別是近年來(lái)宮頸HPV病毒轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)E6/E7的廣泛開(kāi)展，對(duì)于宮頸病毒學(xué)檢測(cè)陰性而轉(zhuǎn)錄水平陽(yáng)性病例的報(bào)道逐漸增多[4-5]，這給臨床工作者對(duì)于早期宮頸病變篩查以及正確宮頸病變分流帶來(lái)了困擾[6]。而P16INK4A近年內(nèi)被發(fā)現(xiàn)在宮頸上皮內(nèi)瘤變的患者中顯著升高，提示P16INK4A可能參與到宮頸CIN病變的發(fā)生發(fā)展或者宮頸HPV感染的過(guò)程中[3,7]。

P16INK4A作為1種抑癌基因，其翻譯的蛋白主要通過(guò)特異性抑制CDK4蛋白以及CDK6蛋白的活性來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期，使得細(xì)胞能顯著減緩由G1期進(jìn)入S期的速率，干擾并抑制細(xì)胞過(guò)度增值[7]。如Genovés 等[8]學(xué)者發(fā)現(xiàn)在肺小細(xì)胞癌患者中，P16INK4A的表達(dá)顯著高于其他肺部惡性腫瘤亞型如腺癌，同時(shí)Genovés J,等認(rèn)為，肺部小細(xì)胞癌中PI3K/AKT/HES信號(hào)通路的激活通過(guò)交錯(cuò)作用捕獲部分轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控因子如miRNA133來(lái)異常激活P16INK4A，并在蛋白水平進(jìn)行了驗(yàn)證；Carozzi 等[9]學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，在FIGO臨床分期Ⅲ期患者中，P16INK4A在卵巢癌中的表達(dá)顯著高于FIGOⅠ期以及FIGO Ⅱ期的患者，并發(fā)現(xiàn)隨著淋巴轉(zhuǎn)移的進(jìn)行以及腹腔內(nèi)腹膜等遠(yuǎn)處病灶的轉(zhuǎn)移，P16INK4A水平呈現(xiàn)一定的遞增趨勢(shì)，但未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，在CINⅡ～Ⅲ患者中，P16INK4A的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織，提示P16INK4A基因在宮頸上皮內(nèi)病變的患者中異常擴(kuò)增，這與之前的研究基本相符，考慮到宮頸HPV感染導(dǎo)致的CD4+CD8+Treg淋巴細(xì)胞的增值可能通過(guò)非編碼RNA的調(diào)控異常激活P16INK4A基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的增強(qiáng)結(jié)合部位，導(dǎo)致P16INK4A基因的異常擴(kuò)增[9]，其結(jié)果為P16INK4A與T淋巴細(xì)胞共同參與到機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)中；另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)，在CINⅡ～Ⅲ級(jí)以及CINⅠ級(jí)宮頸病變患者中，P16INK4A的蛋白水平表達(dá)顯著高于正常宮頸組織，這與之前轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)論一致，但CINⅡ～Ⅲ級(jí)以及CINⅠ級(jí)宮頸病變患者亞組分析并未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮到P16INK4A基因的異常激活呈現(xiàn)出的連貫性可能并不依賴(lài)于CD4+CD8+Treg淋巴細(xì)胞的持續(xù)高水平表達(dá)[10-11]，同時(shí)Solano 等[10]學(xué)者也認(rèn)為，抗原提呈物質(zhì)APC的高水平表達(dá)可能是P16INK4A蛋白下游PI3K/AKT/HES信號(hào)通路活化維持的主要關(guān)鍵因子，Solano 等發(fā)現(xiàn)在APC持續(xù)性低表達(dá)后，P16INK4A基因的擴(kuò)增在一周內(nèi)逐漸衰減。這些都提示P16INK4A基因在宮頸HPV感染導(dǎo)致的宮頸CIN病變患者中參與到了抗腫瘤免疫體系中，而其高水平的表達(dá)可能提示著HPV的活動(dòng)性以及宮頸病變的持續(xù)進(jìn)展。

高危型HPV16、HPV18是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要因素，臨床上對(duì)于HPV16、HPV18陽(yáng)性的宮頸CIN患者考慮到預(yù)后往往較差，普遍采用陰道鏡活檢術(shù)確定組織學(xué)病理檢查結(jié)果，而跨過(guò)宮頸細(xì)胞學(xué)或者E6/E7的檢查，對(duì)于其他宮頸HPV高危陽(yáng)性感染或者低危型感染，臨床上普遍采用規(guī)范的宮頸篩查分流體系進(jìn)行常規(guī)分流治療。本研究在探討了P16INK4A與宮頸HPV感染的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，在宮頸高危型HPV16、HPV18感染患者中，P16INK4A的表達(dá)顯著高于其他宮頸高危型HPV或者低危型HPV感染，提示了P16INK4A對(duì)于作為篩查宮頸病變的重要潛在輔助價(jià)值。 目前具體機(jī)制尚無(wú)闡述，Ding 等[12]學(xué)者考慮到P16INK4A可能異常結(jié)合HPV16、HPV18翻譯蛋白的β亞基而促進(jìn)了抗原提呈物質(zhì)APC的抗原提呈作用，并協(xié)助其逃脫了CD4+CD8+Treg淋巴細(xì)胞的捕獲殺傷作用，但尚無(wú)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。

由此可見(jiàn)，P16INK4A在宮頸CIN病變中異常顯著表達(dá)，并且在HPV16、HPV18陽(yáng)性的宮頸組織中異常高于其他宮頸HPV感染病例，這些都提示了P16INK4A可能在宮頸病變?cè)缙诤Y查中具有潛在輔助診斷價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]鐘輝，劉錦鈺，龍璐雯，等.HPV、EBV、p63、Ki-67在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)及其相關(guān)性〔J〕.診斷病理學(xué)雜志,2014,20(9):586-588.

[2]智艷芳，徐雪峰，李肖甫，等.河南地區(qū)宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌患者HPV感染型別分析〔J〕.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,25(2):142-146.

[3]金艷，曹樹(shù)軍，楊道華，等.P16 INK4a蛋白及人乳頭瘤病毒檢測(cè)對(duì)宮頸癌前病變的預(yù)測(cè)價(jià)值〔J〕.中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2012,35(29):3368-3370.

[4]曹雪梅.宮頸上皮內(nèi)瘤變LEEP治療前后HPV16/18的變化及臨床價(jià)值〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,29(20):2258-2259.

[5]徐小艷，楊金花，林妮，等.脫落細(xì)胞人乳頭瘤病毒L1殼蛋白的半定量檢測(cè)有助于宮頸病變的鑒別診斷〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2014,27(11):1194-1197.

[6]王宏景，龍秀榮，耿建祥，等.宮頸癌瘤組織中HPV感染基因型分布的比較研究〔J〕.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,17(5):533-535.

[7]宋艷，李凌，李青，等.L1殼蛋白和p16INK4a蛋白在不同類(lèi)型宮頸上皮內(nèi)瘤變1級(jí)中的表達(dá)意義〔J〕.中國(guó)藥物與臨床,2012,27(6):741-743.

[8]Genovés J,Alameda F,Mancebo G,et al.Human papillomavirus detection and p16INK4a expression in cervical lesions:a comparative study〔J〕.Human Pathology,2014,45(4):826-833.

[9]Carozzi F,Gillio-Tos A,Confortini M,et al.Risk of high-grade cervical intraepithelial neoplasia during follow-up in HPV-positive women according to baseline p16-INK4A results:a prospective analysis of a nested substudy of the NTCC randomised controlled trial〔J〕.Lancet Oncol,2013,14(2):168-176.

[10]Solano FJ,Wilkinson EJ.p16INK4a Immunohistochemical and Histopathologic Study of Pap Test Cases Interpreted as HSIL Without CIN2-3 Identification in Subsequent Cervical Specimens〔J〕.International Journal of Gynecological Pathology,2015,25(15):181-189.

[11]萬(wàn)曉春，楊慧娟，周曉燕，等.高危型HPV亞型及亞型組合檢測(cè)宮頸癌及高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變的比較研究〔J〕.中國(guó)癌癥雜志,2014,25(5):342-348.

[12]Ding Y,Cheng Y,Sun Q,et al.Mechanical characterization of cervical squamous carcinoma cells by atomic force microscopy at nanoscale〔J〕.Medical Oncology,2015,28(9):1126-1140.

(編輯：吳小紅)

P16INK4A Expression in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Its Relationship with HPV

SONGBaozhi,LIUJiahua,GAOYuling,etal.

FujianMedicalUniversity,FujianProvincialClinicalHospital,Fuzhou,350001

【Abstract】ObjectiveTo investigate P16INK4A expression in the cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and its relationship with HPV.MethodsImmunohistochemical method used to detect 59 cases of cervical epithelial tumors and 30 cases of normal cervical tissues confirmed by pathological examination.ResultsThe positive expression rates of ILK in CIN Ⅰ samples and CIN Ⅱ～Ⅲ samples were 62.50% and 65.71%,which were significantly higher than that of normal cervical tissues(23.33%),and the difference was statistically significant(χ2=8.472,P=0.004<0.05),[(χ2=11.675,P=0.001<0.05)];The positive expression rates of ILK in CIN Ⅰ samples and CIN Ⅱ～Ⅲ samples had no statistically significant difference(χ2=0.064,P=0.800>0.05).The expression rates of P16INK4A in intraepithelial neoplasia tissues with HPV18 or HPV16 were significantly higher than the other high risk HPV types or low risk HPV types(HPV53、HPV58、HPV6).ConclusionThe expression of P16INK4A is significantly higher in CIN,and the expression of P16INK4A may have synergetic effect with HPV18 or HPV16.

【Key words】P16INK4A;Cervical intraepithelial neoplasia(CIN);Immunohistochemical technology;HPV

通訊作者：劉佳華

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.05.010

中圖分類(lèi)號(hào)：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)05-0730-04

(收稿日期2015-06-29修回日期 2016-03-10)