鐮刀菌毒素對斷奶小母豬陰戶、生殖器官指數(shù)、子宮雌激素受體分布和表達(dá)的影響

牛群升　楊維仁　黃麗波　張崇玉　張桂國　梁才芝　姜淑貞

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018)

鐮刀菌毒素對斷奶小母豬陰戶、生殖器官指數(shù)、子宮雌激素受體分布和表達(dá)的影響

牛群升楊維仁*黃麗波張崇玉張桂國梁才芝姜淑貞*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018)

摘要：本試驗(yàn)旨在研究自然霉變飼糧中鐮刀菌毒素對斷奶小母豬陰戶、生殖器官指數(shù)、子宮雌激素受體(ERs)分布和表達(dá)影響。選用35日齡平均體重(8.45±0.94) kg的健康三元雜交(杜×長×大)斷奶小母豬40頭，隨機(jī)分為2個(gè)處理，每個(gè)處理20頭。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂含鐮刀菌毒素的飼糧[玉米赤霉烯酮(ZEN)0.90 mg/kg；嘔吐毒素(DON)1.43 mg/kg；煙曲霉毒素(FUM)5.85 mg/kg)]。預(yù)試期7 d，正試期35 d。結(jié)果表明：試驗(yàn)組35 d仔豬的陰戶長、寬和面積及斷奶母豬生殖器官指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)。雌激素受體α(ERα)免疫陽性物質(zhì)主要見于子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞和子宮肌層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)；雌激素受體β(ERβ)免疫陽性物質(zhì)主要見于內(nèi)膜的動(dòng)脈管壁平滑肌和肌層平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。與對照組相比，試驗(yàn)組仔豬子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞ERα免疫陽性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，且腺泡數(shù)量明顯增多；而ERβ在試驗(yàn)組仔豬子宮肌層平滑肌和動(dòng)脈管壁平滑肌細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組。試驗(yàn)組斷奶母豬子宮中ERα和ERβ的mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)。由此可見，鐮刀菌毒素能夠?qū)嗄绦∧肛i生殖系統(tǒng)造成不良影響，這種影響是通過ERs基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控ERs在子宮中的相對表達(dá)量，進(jìn)而改變生殖器官的發(fā)育實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：鐮刀菌毒素；斷奶小母豬；陰戶；子宮；雌激素受體

鐮刀菌毒素是產(chǎn)毒霉菌在基質(zhì)(糧食、作物及飼料)上生長繁殖過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，是造成全球谷物經(jīng)濟(jì)損失最大的一類污染性霉菌毒素[1-2]。對動(dòng)物健康及生產(chǎn)危害最大的鐮刀菌毒素包括玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)和煙曲霉毒素(fumonisin，F(xiàn)UM)等。鐮刀菌毒素中ZEN對動(dòng)物繁殖危害最大，誘發(fā)母豬雌激素過多癥，如外陰紅腫、直腸脫落、子宮和乳腺增生等[3]。報(bào)道證實(shí)ZEN能夠改變雌激素受體(estrogen receptors，ERs)mRNA在子宮中的表達(dá)量[4-5]。國內(nèi)外研究鐮刀菌毒素對動(dòng)物生殖系統(tǒng)的影響多以純毒素形式進(jìn)行，但實(shí)際生產(chǎn)中，鐮刀菌產(chǎn)生的毒素往往具有多樣性[6]。且鐮刀菌毒素對斷奶母豬子宮角內(nèi)ERs分布的影響尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究自然霉變玉米和霉變玉米蛋白粉中鐮刀菌毒素對斷奶母豬生殖器官發(fā)育、ERs的分布及表達(dá)的影響，為生豬健康生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)管理

選擇35 d的三元雜交(杜×長×大)斷奶小母豬40頭，平均體重(8.45±0.94) kg，隨機(jī)分為2個(gè)處理，每個(gè)處理20頭，各處理間初始體重差異不顯著(P>0.05)。

試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧科技園進(jìn)行。仔豬采用單體籠(0.48 m2)飼養(yǎng)。單體籠使用塑料漏縫地板，安裝有乳頭飲水器和料槽，仔豬自由采食和飲水。試驗(yàn)開始前對豬舍進(jìn)行全面清掃、消毒，試驗(yàn)期間每周進(jìn)行1次豬舍消毒。舍內(nèi)安裝紅外保溫?zé)簦?周豬舍內(nèi)環(huán)境溫度維持在30 ℃左右，之后將豬舍內(nèi)環(huán)境溫度調(diào)整在26～28 ℃，豬舍相對濕度為65%左右。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)飼糧

斷奶母豬基礎(chǔ)飼糧參考NRC(2012)[7]營養(yǎng)需要配制，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組用50%自然霉變玉米和50%霉變玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)飼糧中的玉米和玉米蛋白粉，預(yù)試期7 d，正試期35 d。

表1　飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 3 300 IU,VD3330 IU，VE 24 IU，VK30.75 mg，VB11.50 mg，VB25.25 mg，VB62.25 mg，VB120.026 mg，泛酸 pantothenic acid 15.00 mg，尼克酸 niacin 22.5 mg，生物素 biotin 0.075 mg，葉酸 folic acid 0.45 mg，Mn 6.00 mg, Fe 150 mg, Zn 150 mg, Cu 9.00 mg, I 0.21 mg, Se 0.45 mg。

2)粗蛋白質(zhì)和鈣為實(shí)測值，其他為計(jì)算值。CP and Ca were analyzed values, while the others were calculated values.

3)實(shí)測值 Analyzed values。

1.3樣品采集及指標(biāo)測定

1.3.1陰戶面積測定

試驗(yàn)期間每隔3 d用游標(biāo)卡尺測量仔豬陰戶長、寬，并計(jì)算陰戶面積。仔豬陰戶俯視近似菱形，所以本研究以菱形的面積公式(長×寬)/2來近似計(jì)算仔豬陰戶面積(圖1)，以便比較各處理仔豬陰戶的增大效果。

A：示意圖 Diagram；B：對照組 Control group；C：試驗(yàn)組 Experimental group。

圖1陰戶大小的測量與計(jì)算

Fig.1Measurement and calculation of vulva size

1.3.2生殖器官指數(shù)

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)處理隨機(jī)選取10頭仔豬進(jìn)行屠宰，電擊致死后放血，打開胸腔和腹腔，首先對生殖器官(卵巢+子宮角+陰道前庭)進(jìn)行肉眼觀察，記錄病變情況并稱重，計(jì)算生殖器官指數(shù)?？焖偃?份子宮角樣品，一份置于Bouin’s液中固定，用于檢測免疫組化指標(biāo)；一份置于液氮中，-80 ℃保存，用于測定ERs的mRNA相對表達(dá)量。

生殖器官指數(shù)(g/kg)=生殖器官重量(g)/

豬活體重量(kg)。

1.3.3免疫組化[鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex,SABC)法]

取Bouin’s液中固定好的組織塊，用乙醇逐級脫水，二甲苯透明，采用BMJ23型包埋機(jī)包埋。1)切片機(jī)(LEICA RM2135，德國)進(jìn)行切片(5 μm)，常規(guī)脫蠟至水。2)檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)進(jìn)行抗原熱修復(fù)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(0.01 mol/L，pH 7.2)洗3次，5 min/次(下同)。3)3% H2O2室溫避光孵育30 min，用以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗3次。4)10%胎牛血清37 ℃封閉孵育1 h。5)分別加一抗兔抗雌激素受體α(Erα)(1∶150)多克隆抗體(140113W，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)和兔抗雌激素受體β(ERβ)(1∶150)多克隆抗體(999882W，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，4 ℃ 孵育過夜，PBS洗3次。6)加生物素化羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(1∶200)二抗(K132429E，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37 ℃恒溫箱中孵育1 h，PBS洗3次。7)加辣根過氧化物酶-鏈霉素親和素(1∶150)，37 ℃孵育45 min，PBS洗3次。8)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，控制顯色時(shí)間。9)蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，在明視野顯微鏡下觀察免疫陽性細(xì)胞分布規(guī)律。

1.3.4ERsmRNA相對表達(dá)量的測定

根據(jù)GenBank已報(bào)道的豬的Erα、ERβ和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因(內(nèi)參基因)序列，用Primer 6.0設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物，引物由上海生物工程公司合成(表2)。

取出-80 ℃保存的子宮角樣品50～100 mg，按照Trizol試劑盒說明書(Invitrogen公司，美國)提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量和濃度，結(jié)果顯示光密度(OD)比值均在1.8～2.0之間。檢測后的總RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄按照PrimeScript@RTMaster Mix Perfect Real Time試劑盒說明書進(jìn)行操作(TaKaRa Coad：DDR036A，Lot：BK1302，反應(yīng)體積為20 μL)。RT-PCR的反應(yīng)體系為20 μL，按照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒說明書加入相應(yīng)的反應(yīng)試劑，其擴(kuò)增條件均為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，60 ℃檢測熒光信號。目的基因和內(nèi)參基因分別在不同的PCR管中進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

表2　ERα、ERβ和GAPDH基因的引物序列

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

熒光定量PCR檢測結(jié)果用2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析基因ERα、ERβ的mRNA在子宮中的相對表達(dá)量。數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行均值的雙樣本成對t檢驗(yàn)分析(two sample pairedt-test for the means)，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1鐮刀菌毒素對斷奶母豬陰戶和生殖器官指數(shù)的影響

自然霉變飼糧中鐮刀菌毒素對斷奶母豬陰戶大小的影響見表3。試驗(yàn)開始(0 d)時(shí)所有處理仔豬的陰戶長、寬和面積差異均不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)結(jié)束(35 d)時(shí)試驗(yàn)組仔豬的陰戶長、寬和面積都顯著大于對照仔豬(P<0.05)。試驗(yàn)組斷奶母豬生殖器官指數(shù)較對照組顯著升高(P<0.05)。

2.2鐮刀菌毒素對斷奶母豬子宮中ERα、ERβ分布的影響

免疫組化結(jié)果顯示仔豬子宮中ERα、ERβ免疫陽性反應(yīng)為黃色、棕黃色或棕色，陰性對照組織不著色。說明本試驗(yàn)采用的免疫組化SABC法具有免疫反應(yīng)的特異性。

表3　鐮刀菌毒素對斷奶母豬陰戶大小和生殖器官指數(shù)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.2.1鐮刀菌毒素對斷奶母豬子宮中ERα分布的影響

本試驗(yàn)觀察結(jié)果顯示，ERα主要見于子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞和子宮肌層細(xì)胞，且為細(xì)胞質(zhì)著色，而在子宮腔上皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)ERα分布(圖2-A、圖2-D)。與對照組(圖2-B、圖2-C)相比，試驗(yàn)組仔豬子宮腺ERα免疫陽性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，且腺泡數(shù)量也明顯增多(圖2-E、圖2-F)。試驗(yàn)組的腺上皮細(xì)胞大部分呈強(qiáng)陽性反應(yīng)(圖2-E、圖2-F)，而對照組的腺上皮細(xì)胞ERα免疫反應(yīng)弱，且有不著色的上皮細(xì)胞存在，但2組子宮內(nèi)膜基質(zhì)呈ERα免疫陽性的細(xì)胞數(shù)量無明顯差別。

A、D為低倍圖，B、C、E、F為高倍圖；LE為子宮腔上皮，G為子宮腺，S為固有層基質(zhì)，M為子宮肌層，V為血管；紅色箭頭示ERα免疫陽性細(xì)胞，綠色箭頭為陰性。

A and D were macroscopical pictures. B, C, E and F were microscopic pictures. LE was epithelium of uterine. G was uterine gland. S was stroma of lamina propria. M was myometrium. V was blood vessel. Red arrows showed immunoreactive cells of ERα, and green arrows showed immune-negative cells of ERα.

A、B、C：對照組；D、E、F：試驗(yàn)組。下圖同。

A, B and C: control group; D, E and F: experimental group. The same sa below.

圖2鐮刀菌毒素對斷奶母豬子宮中ERα分布的影響

Fig.2Effects ofFusariumtoxins on the ERα distribution in uterus of weaning gilts

2.2.2鐮刀菌毒素對斷奶母豬子宮中ERβ分布的影響

ERβ免疫陽性反應(yīng)物質(zhì)主要見于內(nèi)膜的動(dòng)脈管壁平滑肌和子宮肌層平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)(圖3-A、圖3-D)，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而在子宮腺上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞大多呈陰性(圖3-B、圖3-C、圖3-E、圖3-F)，偶見有ERβ免疫陽性物質(zhì)分布在腺上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，著色較弱。與對照組相比，試驗(yàn)組ERβ著色更強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量更多，多分布在肌層平滑肌和動(dòng)脈管壁平滑肌細(xì)胞(圖3-E、圖3-F)。對照組中發(fā)現(xiàn)少量基質(zhì)細(xì)胞中存在ERβ(圖3-C)。2組對比ERβ在動(dòng)脈管壁平滑肌分布無明顯區(qū)別。

2.3鐮刀菌毒素對斷奶母豬子宮ERs的mRNA相對表達(dá)量的影響

鐮刀菌毒素對斷奶母豬子宮ERs的mRNA相對表達(dá)量的影響見圖4，與對照組相比，試驗(yàn)組子宮中ERα和ERβ的mRNA相對表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。

3討論

試驗(yàn)中盡管我們選擇優(yōu)質(zhì)原料配制對照飼糧，但是遺憾的是對照飼糧中也檢測到不同程度的毒素含量，這進(jìn)一步說明我國鐮刀菌毒素污染的普遍性及本研究的迫切性。本試驗(yàn)對照飼糧中ZEN、DON和FUM的含量低于我國飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(ZEN含量<0.5 mg/kg，GB13078.2—2006；DON含量<1 mg/kg，GB13078.3—2007；我國對于飼料中FUM含量還沒有制定相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn))以及歐盟關(guān)于仔豬飼糧中ZEN、DON和FUM含量分別<0.1、0.9和5 mg/kg[8]的最高限量規(guī)定。而試驗(yàn)飼糧中ZEN、DON和FUM含量均超過我國飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和歐盟仔豬飼糧中的最高限量，因此對照組鐮刀菌毒素的含量不影響試驗(yàn)組結(jié)果的判斷。本試驗(yàn)條件下，鐮刀菌毒素顯著降低了斷奶母豬平均日采食量和平均日增重，料重比則顯著升高[9]。

A、B、D為肌層和動(dòng)脈管壁平滑肌，C為基質(zhì)細(xì)胞，E為肌層和腺上皮細(xì)胞，F(xiàn)為動(dòng)脈管壁平滑肌細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞；LE為子宮腔上皮，G為子宮腺，S為固有層基質(zhì)，M為子宮肌層，V為血管；紅色箭頭示ERβ免疫陽性細(xì)胞，綠色箭頭為陰性。

A, B and D were smooth muscle of muscular layer and arterial wall. C was stromal cell. E was cell of muscle layer and glandular epithelium. F was arterial smooth muscle and gland epithelial cell. LE was epithelium of uterine. G was uterine gland. S was stroma of lamina propria. M was myometrium. V was blood vessel. Red arrows showed immunoreactive cells of ERβ, and green arrows showed immune-negative cells of ERβ.

圖3鐮刀菌毒素對斷奶母豬子宮中ERβ分布的影響

Fig.3Effects ofFusariumtoxins on the ERβ distribution in uterus of weaning gilts

數(shù)據(jù)柱標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Value columns with difference small mean significant difference (P<0.05).

圖4鐮刀菌毒素對斷奶母豬子宮中ERα和ERβ的mRNA相對表達(dá)量的影響

Fig.4Effects ofFusariumtoxins on the relative mRNA expression ofERαandERβin uterus of weaning gilts (n=10)

3.1鐮刀菌毒素對斷奶母豬生殖器官的影響

鐮刀菌毒素中對生殖系統(tǒng)危害最大的是ZEN。ZEN具有雌激素效應(yīng)，能與動(dòng)物體內(nèi)的ERs結(jié)合[10]，誘發(fā)母豬雌激素過多癥，典型癥狀如陰戶紅腫潮濕、陰道直腸脫落、子宮增生以及乳腺增大等[3]。Rainey等[11]發(fā)現(xiàn)母豬采食1.5 mg/kg ZEN的飼糧后，7 d便出現(xiàn)陰戶紅腫現(xiàn)象。James等[10]報(bào)道仔豬攝入ZEN(3.61和4.33 mg/kg)污染飼糧，子宮重量幾乎增加1倍。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量ZEN(1.1～3.2 mg/kg)能夠顯著增加斷奶母豬生殖器官指數(shù)和陰戶面積，且隨ZEN增加呈劑量依賴特性。本試驗(yàn)條件下，試驗(yàn)組仔豬陰戶明顯紅腫，陰戶長、寬和面積均顯著大于對照組仔豬，說明自然霉變飼糧中的鐮刀菌毒素(0.90 mg/kg ZEN)對試驗(yàn)仔豬生殖器官產(chǎn)生毒害作用，這與前人研究結(jié)果一致。但本試驗(yàn)飼糧中除了ZEN外，還有一定劑量的DON(1.43 mg/kg)和FUM(5.85 mg/kg)。體外試驗(yàn)證實(shí)，ZEN的代謝產(chǎn)物α-玉米赤霉烯醇(7.5 μmoL/L)、β-玉米赤霉烯醇(30.0 μmoL/L)和DON(1.88 μmoL/L)都能夠顯著抑制卵母細(xì)胞核成熟，然而2種毒素的作用機(jī)制尚不明確[13]。ZEN和DON(劑量均為3.12 μmoL/L)都能夠誘導(dǎo)紡錘體結(jié)構(gòu)畸形，進(jìn)而導(dǎo)致卵母細(xì)胞數(shù)量減少和胚胎異常，但是并沒有發(fā)現(xiàn)ZEN和DON之間有協(xié)同作用[14]，更未見DON影響外陰和生殖器官指數(shù)的報(bào)道，也未見FUM對動(dòng)物生殖系統(tǒng)的危害報(bào)道。而且鐮刀菌毒素在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過程復(fù)雜，體外試驗(yàn)不足以定論。本試驗(yàn)條件下的鐮刀菌毒素對仔豬生殖器官的毒性影響是毋庸置疑的。有關(guān)ZEN、DON和FUM對斷奶母豬生殖器官影響的相互關(guān)系，本課題組動(dòng)物試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

3.2鐮刀菌毒素對斷奶母豬ERα、ERβ在子宮中分布的影響

在哺乳動(dòng)物中，ERs主要有ERα及ERβ 2種亞型，均屬核受體，但近些年發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)廣泛分布[15]。ERα及ERβ在不同組織中均有分布，但有所差別，如ERβ主要集中在生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、大腦以及骨組織中，而ERα則主要分布在生殖系統(tǒng)和乳腺組織中[16]。ERα及ERβ與雌激素具有相似的結(jié)合能力，但是在雌激素作用下，ERα轉(zhuǎn)錄活性大于ERβ，表明雌激素作用主要通過ERα調(diào)控[17]。

許琴[18]報(bào)道顯示，ERα主要表達(dá)于比格犬子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞中，而ERβ主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞核及胞質(zhì)，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)。ZEN能與動(dòng)物體內(nèi)的ERs結(jié)合，從而刺激ERs介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。不同亞型ERs與ZEN的親和力不同，Mueller等[19]報(bào)道ERα比ERβ與ZEN更具親和力。研究表明，ZEN可能是通過影響雌二醇與ERs結(jié)合，提高去卵巢大鼠子宮ERs數(shù)量[20]。DON和FUM對斷奶母豬ERs在子宮中的表達(dá)分布尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)免疫組化結(jié)果表明，斷奶母豬子宮中各細(xì)胞成分均有ERα、ERβ分布。子宮中ERα主要分布在子宮腺上皮細(xì)胞，而ERβ則主要分布于動(dòng)脈管壁平滑肌細(xì)胞、肌層平滑肌細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞。與對照組相比，試驗(yàn)組仔豬子宮腺中ERα分布廣泛且子宮腺增生，促進(jìn)了子宮腺發(fā)育，與ERα在子宮中的相對表達(dá)量顯著增加的結(jié)果一致。試驗(yàn)組仔豬子宮中ERβ不僅廣泛分布在動(dòng)脈管壁平滑肌細(xì)胞和肌層平滑肌細(xì)胞，而且腺上皮細(xì)胞也有大量分布。本研究發(fā)現(xiàn)ERβ在血管內(nèi)皮、肌層平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均有廣泛分布，從而引起子宮平滑肌細(xì)胞增生，使得子宮壁增厚，這與生殖器官指數(shù)增大結(jié)果一致，但ERβ能否通過血管內(nèi)皮進(jìn)入血液以及DON和FUM是否影響母豬ERs在子宮中的分布和表達(dá)尚需進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

3.3鐮刀菌毒素對斷奶母豬子宮ERα、ERβ的mRNA相對表達(dá)量的影響

在正常大鼠子宮中，ERα與ERβ的mRNA均有表達(dá)，但ERα的表達(dá)占優(yōu)勢[21]。研究顯示ERα的mRNA主要分布在子宮中，而ERβ的mRNA則主要分布在卵巢中[22-23]。Kuiper等[24]研究表明，子宮中ZEN及其衍生物與ERs結(jié)合后從胞汁進(jìn)入胞核的時(shí)間比雌激素進(jìn)入胞核的時(shí)間長，從而引起RNA和RNA聚合酶活性增加。Zhang等[4]用含有不同劑量ZEN飼糧飼喂妊娠小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，小鼠子宮和卵巢中ERs表達(dá)量與ZEN含量之間存在劑量關(guān)系，均隨ZEN劑量的增加而增加。王定發(fā)等[5]在飼糧中分別添加0.5和2.0 mg/kg ZEN，均顯著增加了青年母豬子宮中ERα的mRNA表達(dá)量，分別比對照組提高了15%和38%；而ERβ的mRNA的表達(dá)量則顯著降低。仔豬采食1.5 mg/kg ZEN污染飼糧28 d，子宮ERα的mRNA表達(dá)量變化不顯著，而ERβ的mRNA表達(dá)量卻是對照組的2倍[25]。DON和FUM是否會(huì)影響斷奶母豬子宮ERα、ERβ的mRNA表達(dá)量尚未見報(bào)道。本研究表明，斷奶母豬飼喂自然霉變飼糧35 d，顯著上調(diào)斷奶母豬子宮中ERα和ERβ的mRNA相對表達(dá)量，該結(jié)果與ERs在子宮中的分布一致。但多種毒素(ZEN、DON和FUM)之間的相互作用尚需進(jìn)一步證實(shí)。本研究表明，鐮刀菌毒素(尤其ZEN)對斷奶母豬陰戶(紅腫)和生殖器官(指數(shù)增大)的影響是通過改變子宮中 ERs的分布和表達(dá)水平來調(diào)控的。

4結(jié)論

本研究條件下，鐮刀菌毒素(ZEN 0.90 mg/kg，DON 1.43 mg/kg，F(xiàn)UM 5.85 mg/kg)顯著增加斷奶母豬陰戶和生殖器官指數(shù)，顯著增強(qiáng)ERα和ERβ在子宮中的分布和表達(dá)量。因此，鐮刀菌毒素(尤其ZEN)是通過增強(qiáng)ERα和ERβ在子宮中的分布和表達(dá)量來調(diào)控?cái)嗄棠肛i生殖器官發(fā)育的。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳心儀.亞洲地區(qū)飼料和畜禽養(yǎng)殖業(yè)霉菌毒素危害實(shí)況[J].飼料廣角,2008(10):39-42.

[2]敖志剛,陳代文.2006～2007年中國飼料及飼料原料霉菌毒素污染調(diào)查報(bào)告[J].中國畜牧獸醫(yī),2008,35(1):152-156.

[3]STOB M,BALDWIN R S,TUITE J,et al.Isolation of an anabolic,uterotrophic compound from corn infected withGibberellazeae[J].Nature,1962,196(4861):1318.

[4]ZHANG Y Y,JIA Z Q,YIN S T,et al.Toxic effects of maternal zearalenone exposure on uterine capacity and fetal development in gestation rats[J].Reproductive Sciences,2014,21(6):743-7533.

[5]王定發(fā),彭運(yùn)智,張妮婭,等.日糧中玉米赤霉烯酮和大豆異黃酮聯(lián)合作用對后備母豬生殖器官發(fā)育和雌激素受體基因轉(zhuǎn)錄的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42(2):243-250.

[6]楊曉飛.四川地區(qū)主要飼料霉菌毒素分布規(guī)律的研究[D].碩士學(xué)位論文.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[7]NRC.Nutrient requirements of swine[M].11th ed.Washington D.C.:National Academy Press,2012.

[8]European Commission.Commission recommendation (2006/576/EC) of 17 August 2006 on the presence of deoxynivalenol,zearalenone,ochratoxin A,T-2 and HT-2 and fumonisins in products intended for animal feeding[S].Official Journal of the European Union L 229,2006.

[9]陳祥興,楊維仁,張崇玉,等.鐮刀菌毒素對斷奶仔豬生長性能、小腸二糖酶活性和抗氧化能力的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(6):1875-1882.

[10]JAMES L J,SMITH T K.Effect of dietary alfalfa on zearalenone toxicity and metabolism in rats and swine[J].Journal of Animal Science,1982,55(1):110-118.

[11]RAINEY M R,TUBBS R C,BENNETT L W,et al.Prepubertal exposure to dietary zearalenone alters hypothalamo-hypophysial function but does not impair postpubertal reproductive function of gilts[J].Journal of Animal Science,1990,68(7):2015-2022.

[12]CHEN X X, YANG C W,HUANG L B,et al.Zearalenone altered the serum hormones,morphologic and apoptotic measurements of genital organs in post-weaning gilts[J].Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2015,28(2):171-179.

[13]ALM H,GREISING T,BRüSSOW K P,et al.The influence of the mycotoxins deoxynivalenol and zearalenol oninvitromaturation of pig oocytes andinvitroculture of pig zygotes[J].Toxicology in Vitro,2002,16(6):643-648.

[14]MALEKINEJAD H,SCHOEVERS E J,DAEMEN I J J M,et al.Exposure of oocytes to theFusariumtoxins zearalenone and deoxynivalenol causes aneuploidy and abnormal embryo development in pigs[J].Biology of Reproduction,2007,77(5):840-847.

[15]LEVIN E R.Invited review:cell localization,physiology,and nongenomic actions of estrogen receptors[J].Journal of Applied Physiology,2001,91(4):1860-1867.

[16]WANG L,ANDERSSON S,WARNER M,et al.Estrogen receptor (ER)β knockout mice reveal a role for ERβ in migration of cortical neurons in the developing brain[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(2):703-708.

[17]COUSE J F,KORACH K S.Estrogen receptor null mice:what have we learned and where will they lead us?[J].Endocrine Reviews,1999,20(3):358-417.

[18]許琴.比格犬子宮與卵巢Erα、ERβ的表達(dá)及ERβ新剪接異構(gòu)體的研究[D].博士學(xué)位論文.長春:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2013.

[19]MUELLER S O,SIMON S,CHAE K,et al.Phytoestrogens and their human metabolites show distinct agonistic and antagonistic properties on estrogen receptor α (ERα) and ERβ in human cells[J].Toxicological Sciences,2004,80(1):14-25.

[20]呂斌,聞京偉,李振國,等.玉米赤酶烯酮對大鼠子宮雌激素受體影響的探討[J].醫(yī)藥論壇雜志,2010,31(18):37-38.

[21]HIROI H,INOUE S,WATANABE T,et al.Differential immunolocalization of estrogen receptor α and β in rat ovary and uterus[J].Journal of Molecular Endocrinology,1999,22(1):37-44.

[22]COUSE J F,LINDZEY J,GRANDIEN K,et al.Tissue distribution and quantitative analysis of estrogen receptor-α (ERα) and estrogen receptor-β (ERβ) messenger ribonucleic acid in the wild-type and ERα-knockout mouse[J].Endocrinology,1997,138(11):4613-4621.

[23]KUIPER G G,ENMARK E,PELTO-HUIKKO M,et al.Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1996,93(12):5925-5930.

[24]KUIPER-GOODMAN T,SCOTT P M,WATANABE H.Risk assessment of the mycotoxin zearalenone[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology,1987,7(3):253-306.

[25]OLIVER W T,MILES J R,DIAZ D E,et al.Zearalenone enhances reproductive tract development,but does not alter skeletal muscle signaling in prepubertal gilts[J].Animal Feed Science and Technology,2012,174(1/2):79-85.

(責(zé)任編輯武海龍)

Effects ofFusariumToxins on Vulva, Reproductive Organ Index,Distribution and Expression of Estrogen Receptors in Uterus of Weaning Gilts

NIU QunshengYANG Weiren*HUANG LiboZHANG ChongyuZHANG Guiguo LIANG CaizhiJIANG Shuzhen*

(College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)

Abstract:The aims of the study were to investigate the effect of Fusarium toxins on vulva, reproductive organ index, distribution and expression of estrogen receptors (ERs) of uterus in weaning gilts. A total of 40 healthy weaning gilts (Duroc×Large White×Landrace) aged at 35 d with an average body weight of (8.45±0.94) kg were used in the study. Gilts were randomly allocated into 2 treatments with 20 gilts in each group. Control group was fed a basal diet, and experimental group were exposed to feed naturally contaminated with Fusarium toxins [zearalenone (ZEN) 0.90 mg/kg; deoxynivalenol (DON) 1.43 mg/kg; fumonisin (FUM) 5.85 mg/kg] for 35 days after 7 days adaptation. The results showed that the length, width and area of vulva and reproductive organ index of weaning gilts at 35 days in experimental group were significantly higher than those in control group (P<0.05). There was a higher intensity of immunopositive staining for estrogen receptors α (ERα) in cytoplasm of endometrial glandular epithelial cells and uterine muscle cells. Whereas immunopositive staining for estrogen receptors β (ERβ) was most expressed in cytoplasm of smooth muscle cells in the intima of arteries and muscle layer smooth muscle cells. The ERα positive reaction and acinus number of the endometrial glandular epithelial cells in experimental groups were higher than that in control group. However, the ERβ positive reaction of the toxins-treated gilts was found in the smooth muscle cells of the uterine muscle and the arterial wall smooth muscle cells. The relative mRNA expressions of ERα and ERβ in uterus of weaning gilts in experimental group were significantly higher than those in control group (P<0.05). The results suggested Fusarium toxins have deleterious effect on reproductive system. This effect is mediated through changing the expression of ERs regulated by the transcription of ERs gene in uterus, and then changed the development of the reproductive organs.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(5)：1525-1533]

Key words:Fusarium toxins; weaning gilts; vulva; uterus; estrogen receptors

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.05.029

收稿日期：2015-12-04

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT-08-05)

作者簡介：牛群升(1988—)，男，山東臨沂人，碩士研究生，從事動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail: qunshengniu@163.com *通信作者：楊維仁，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: wryang@sdau.edu.cn；姜淑貞，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: shuzhen305@163.com

中圖分類號：S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1006-267X(2016)05-1525-09

*Corresponding authors: YANG Weiren, professor, E-mail: wryang@sdau.edu.cn; JIANG Shuzhen, associate professor, E-mail: shuzhen305@163.com