伊馬替尼對尿毒癥心肌病大鼠心肌纖維化的保護作用*

馬　欣，王　麗，芶芳芳，沈宏春，曹　靈，樊均明，4△

(1.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎病內科，四川瀘州 646000；2瀘州醫(yī)學院附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結合研究中心，四川瀘州 646000；3.瀘州醫(yī)學院中西醫(yī)結合學院，四川瀘州 646000；4.四川大學生物治療國家重點實驗室，成都 610041)

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伊馬替尼對尿毒癥心肌病大鼠心肌纖維化的保護作用*

馬欣1，王麗2，芶芳芳1，沈宏春3，曹靈1，樊均明1，4△

(1.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎病內科，四川瀘州 646000；2瀘州醫(yī)學院附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結合研究中心，四川瀘州 646000；3.瀘州醫(yī)學院中西醫(yī)結合學院，四川瀘州 646000；4.四川大學生物治療國家重點實驗室，成都 610041)

[摘要]目的觀察伊馬替尼通過調控PDGFRα的表達改善尿毒癥大鼠心肌纖維化的作用。方法將72只大鼠分為Sham 組，5/6 組和5/6+I 組，5/6組建立大鼠尿毒癥模型，5/6+I組建模后行伊馬替尼灌胃，Sham組僅行腎臟游離。所有大鼠于術后8周行心臟病理染色；實時定量熒光PCR、免疫組織化學測定心臟血小板衍生生長因子受體α(PDGFRα) mRNA及蛋白表達。結果5/6組和5/6+I組大鼠尿蛋白、Scr、BUN均較Sham組明顯增加(P<0.01).Sham組心肌病理評分顯著低于5/6組(P<0.01)，而5/6+I組顯著低于5/6組(P<0.01)；5/6組心肌間質膠原容積分數值明顯高于Sham組(P<0.01)；5/6+I組高于Sham組(P<0.05)，但與5/6組比較，明顯下降(P<0.05)；5/6組和5/6+I組的PDGFRα mRNA和蛋白表達均顯著高于Sham組(均P<0.01)；而5/6+I組明顯低于5/6組(P<0.05)。結論伊馬替尼可以通過抑制PDGFRα表達減少尿毒癥大鼠心臟病理損傷及纖維化的程度。

[關鍵詞]心肌疾?。恍募?；纖維化；伊馬替尼；尿毒癥心肌病;PDGFR

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是慢性腎臟疾病 (chronic kidney disease，CKD)最常見的并發(fā)癥，是終末期腎病(ERSD)患者死亡的主要原因。尿毒癥心肌病是CKD所致的心肌損害，如能有效控制尿毒癥心肌病可以顯著改善CKD患者的預后[1]。目前臨床上針對尿毒癥心肌病的治療手段依然十分有限，治療效果仍不甚滿意，其原因可能與該病發(fā)生的具體機制尚不十分明了有關。近來研究發(fā)現(xiàn)，心肌的纖維化形成機制可能與血小板衍生生長因子(PDGF)過度表達有關[2]。有研究表明，心肌間質成纖維細胞在心臟PDGF-D活躍區(qū)域過度表達的情況下發(fā)生明顯增殖，這導致了心臟纖維化，擴張型心肌病和隨后的心臟衰竭的發(fā)生[3]。伊馬替尼是一種用于治療慢性髓細胞性白血病和胃腸道間質瘤的酪氨酸激酶抑制劑，其競爭性阻斷腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)在BCR-ABL酪氨酸激酶上的結合位置，產生治療作用。目前研究提示[4-6]，伊馬替尼除抑制BCR-ABL酪氨酸激酶活力外，對PDGF受體酪氨酸激酶的活力也存在同等程度的抑制。因此，是否能通過應用該藥物拮抗尿毒癥心肌病的發(fā)展，是一個值得研究的臨床課題。本研究擬對該設想進行探討，為找尋尿毒癥心肌病的有效方法提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠72只，購于瀘州醫(yī)學院SPF動物實驗中心，體質量200～250 g，10～16周。主要試劑：甲磺酸伊馬替尼購自諾華制藥公司；免疫組織化學SP劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗大鼠血小板衍生生長因子受體α(PDGFRα)Ⅰ抗及抗大鼠Ⅱ抗購自Santa Cruz公司；mRNA 提取試劑盒RNeasyMini Kit購自Qiagen公司；逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和染料法熒光實時定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1動物模型建立與分組

1.2.1.1尿毒癥模型的建立按照Zhao等[7]5/6腎切方法構建尿毒癥模型。手術主要步驟如下：戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定大鼠于手術臺，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。取大鼠左側腹部切口，分離出左腎并臨時夾閉腎蒂，切除左腎上下極各1/3組織，吸收性明膠海綿創(chuàng)面止血后關閉腹腔。1周后再次手術，取右側腹部切口摘除右腎。逐層關腹，術畢將大鼠平臥于鼠盒，清醒后分籠飼養(yǎng)。

1.2.1.2實驗分組與處理實驗分成3組(每組24只)。假手術組(Sham組)：僅行腎臟游離，不切除腎臟；5/6腎切組(5/6組)：予以5/6腎臟切除；伊馬替尼實驗組 (5/6+I組)：動物先行5/6腎切，術后，以10 mg/kg劑量將伊馬替尼溶解至蒸餾水中，每日灌胃。Sham組和5/6組在相同時間點給予等量生理鹽水灌胃。所有大鼠均于術后2、6、8周時放于代謝籠收集尿液，同時每組處死8只大鼠，留取血清。術后8周處死時，同時收集心臟標本，分別于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2檢測指標及方法

1.2.2.1腎臟功能指標測定收集尿液后，全自動生化分析儀檢測尿蛋白。干燥管腔靜脈采血3 mL，離心后取上層血清，全自動血清自動生物化學儀(Beck-man CX7，美國)檢測尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。

1.2.2.2心臟病理改變采用蘇木素-伊紅(HE)染色，普通光學顯微鏡下觀察心肌組織病理改變。對心肌組織的改變參照Rona的標準進行評分：(1)心肌纖維有無肥大、變性、壞死；(2)間質有無充血、水腫、炎細胞浸潤、結締組織增生；(3)心內膜、心外膜有無充血、水腫、炎細胞浸潤。各種病變按由輕到重的程度分別評分為1、2、3、4分，無病變?yōu)?分，每張切片取8個高倍視野進行評分并取平均值，數據進行統(tǒng)計學處理。

1.2.2.3心肌纖維化測定采用苦味酸-天狼星紅染色法行膠原染色，心肌細胞呈黃色，膠原纖維呈紅色，采用光學顯微鏡測定。應用Image Pro Plus software 6.0 圖像分析系統(tǒng)計算心肌組織中膠原容積分數(CVF)，CVF=心肌間質膠原面積/視野總面積,每張切片取8個高倍視野，并取平均值。

1.2.2.4實時定量熒光PCR(Real-time PCR)法測定磷酸化PDGFRα mRNA表達按照說明書的步驟，將適量的心臟組織研磨成勻漿液，使用RNeasyMini Kit 提取mRNA 后，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 逆轉錄試劑盒，先加入gDNA Eraser去除基因組的DNA，然后直接進行逆轉錄反應合成cDNA。在Applied Biosystems Step One Plus System Real-time PCR儀上進行實時熒光定量擴增。SYBR反應體系為20 μL。根據SYBR Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒和Applied Biosystems Step One Plus System的使用說明，PCR反應條件:95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。以熔解曲線判定反應產物的特異性。利用PCR儀配套軟件分析獲得產物Ct值，依據公式ΔCt = Ct目的基因- Ct內參基因求得2組ΔCt 值，根據實時定量PCR原理，待擴增目的基因的Ct值與該基因的拷貝數呈反比，ΔCt值越大表明基因表達量越低，用2-ΔΔCt的方法求得各個目的基因mRNA的相對含量。

1.2.2.5免疫組織化學法測定心肌磷酸化PDGFRα 蛋白表達采用免疫組織化學法，按照實驗試劑盒操作說明書進行。陽性細胞染色為棕褐色。陽性細胞表達采用半定量分析：計數每個視野下陽性細胞個數，以陽性細胞數/每視野表示，每張切片測定8個隨機高倍視野，取平均值為該切片陽性表達值。

2結果

2.1腎功能檢測實驗至術后第2周時，5/6組和5/6+I組大鼠尿蛋白、Scr、BUN均較Sham組明顯增加(P<0.01)，并隨時間延長增加，第8周時升高顯著。但5/6組與5/6+I組比較，各指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　各組大鼠不同時間段腎功能指標比較±s)

a：P<0.01，與Sham組同時段比較。

2.2心肌病理損傷及纖維化程度

2.2.1心肌病理形態(tài)觀察Sham組心肌組織無明顯病理改變，基本正常，未見膠原組織增生；5/6組心肌細胞排列紊亂，細胞肥大，膠原組織明顯增生，心肌間質纖維化明顯；5/6+I組心肌組織病變明顯減輕。Sham組心肌病理評分顯著低于5/6組[(0.21±0.11)分vs.(10.04±1.24)分，P<0.01]，而5/6+I組顯著低于5/6組[(5.32±0.87)分，P<0.01]，見圖1。

2.2.2心肌組織CVF測量結果天狼星染色心肌細胞呈黃色,膠原纖維呈紅色。5/6組心肌纖維化程度最重，心肌間質膠原含量最多，其CVF值為(28.2±9.4)%，明顯高于Sham組(7.1±2.0)%，P<0.01；5/6+I組CVF值為(15.2±4.3)%，雖高于Sham組(P<0.05)，但較5/6組顯著減小(P<0.05)，見圖2。

2.3心肌組織PDGFRα的mRNA表達Real-time PCR結果顯示Sham組的PDGFRα mRNA的相對表達量為0.544 4，5/6組為2.468 7，5/6+I組為1.437 5，統(tǒng)計分析表明5/6組和5/6+I組表達均顯著高于Sham組(P<0.01)；而5/6+I組明顯低于5/6組(P<0.05)。

2.4心肌磷酸化PDGFRα蛋白表達免疫組織化學檢測顯示PDGFRα主要表達于心肌間質細胞中。結果顯示，5/6組和5/6+I組均可見成棕黃色的顆粒表達于心肌間質細胞中，5/6組PDGFRα蛋白陽性表達率為(8.5±1.9)%，5/6+I組陽性表達率為(5.6±1.1)%，與Sham組[(1.6±0.3)%]比較，均顯著性升高(均P<0.01)；而5/6+I組的PDGFRα陽性染色率明顯低于5/6組(P<0.05)，見圖3。

A：Sham組；B：5/6組；C：5/6+I組。

圖1各組大鼠心肌組織病理學改變(HE ×200)

A：Sham組；B：5/6組；C：5/6+I組。

圖2各組大鼠心肌組織膠原表達(天狼星紅染色 ×400)

A：5/6+I組(PDGFRα表達較5/6組明顯減少)；B：5/6組(PDGFRα表達明顯增強)；C：Sham組(見少量間質細胞PDGFRα染色)。

圖3各組大鼠心肌組織PDGFRα蛋白表達(免疫組織化學染色 ×400)

3討論

尿毒癥心肌病是在慢性腎臟疾病的基礎上發(fā)生的心臟病變，包括形態(tài)和功能的改變，主要表現(xiàn)為心肌肥大，毛細血管密度下降，心肌間質纖維化及心室重塑，最終導致左室肥厚，心室舒張、收縮功能失調，心律失常和心力衰竭[8]。其中，心肌纖維化是導致該病進展的重要原因。因此，抑制心肌間質的纖維化，阻斷纖維化發(fā)展的通路，對尿毒癥心肌病的治療有十分重要的意義。

近年研究發(fā)現(xiàn)，PDGF在心肌纖維化的發(fā)展進程中扮演了重要角色。PDGF是一種可促進成纖維細胞及血管平滑肌細胞分裂增殖，并具有趨化作用的生長因子，能夠促進肌纖維母細胞產生膠原，還可通過上調組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)抑制膠原酶的作用，從而減少細胞外基質的降解，最終導致纖維化的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。Ma等[11]在DOCA/salt誘導心肌纖維化的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，PDGF/PDGFR信號通路參與了心肌纖維化的發(fā)生，并且通過該通路可加速心肌炎性反應。在心肌纖維化的過程中，單核巨噬細胞等炎癥細胞增殖，分泌大量的PDGF，活化的PDGF與PDGFR結合，導致PDGF/PDGFR信號通路活化，從而促進心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展。本次研究發(fā)現(xiàn)PDGFR蛋白的表達在尿毒癥心肌病的模型動物中明顯升高，這說明PDGF及其受體可能是參與尿毒癥心肌病進展的重要因素之一，針對PDGF/PDGFR信號通路活化作為靶點的治療手段，有可能成為減輕尿毒癥心肌病的重要措施。

伊馬替尼是一種酪氨酸激酶受體抑制劑，是能特異性抑制PDGFR酪氨酸激酶和Abl酪氨酸激酶自磷酸化的低分子拮抗劑[12]。該藥對于治療慢性髓細胞性白血病和胃腸道間質瘤有較好的療效。同時，由于PDGFR在纖維化過程中的重要角色，目前，已有學者開始關注該藥物在各種纖維化所致疾病中的應用前景。比如，Chaudhary等[13]在博來霉素誘導的肺纖維化大鼠中，給予甲磺酸伊馬替尼50 mg·kg-1·d-1口服可改善肺纖維化；最近Pope等[14]發(fā)現(xiàn)甲磺酸伊馬替尼能夠通過改善皮膚的纖維化起到治療系統(tǒng)性硬皮病的作用。因此，伊馬替尼有可能是針對尿毒癥心肌病治療的一種極具潛力的新型藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，在使用伊馬替尼干預之后，能明顯減輕尿毒癥大鼠心肌纖維化水平及病理損傷。同時，對PDGFRα的測定發(fā)現(xiàn)，通過該藥治療的動物心肌組織內PDGFRα的基因和蛋白表達水平均有下降，這說明，伊馬替尼對尿毒癥導致的心肌損傷產生保護作用，這種保護作用與其對PDGFRα的抑制所致的纖維化水平降低存在密切聯(lián)系。在最近的有關報道中提到，伊馬替尼可有效改善自發(fā)性高血壓大鼠的心室重構，降低心肌組織中PDGFR表達水平[15]。該研究與本研究發(fā)現(xiàn)一致。

綜上，本研究認為伊馬替尼能通過對PDGFR的活化抑制，有效地減輕尿毒癥心肌病引起的心臟損害。對該類藥物的研究將成為尿毒癥心肌病的治療的新思路。

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Protective effect of imatinib on myocardial fibrosis in uremic rats*

MaXin1,WangLi2,GouFangfang1,ShenHongchun3,CaoLing1,FanJunming1，4△

(1.DepartmentofNephrology，AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege，Luzhou,Sichuan646000,China;2.LaboratoryofOrganFibrosisProphylaxisandTreatmentbyCombineTraditionalChineseandWesternMedicine,ResearchCenterofCombineTraditionalChineseandWesternMedicine,theAffiliatedTCMHospital,LuzhouMedicalCollege,Luzhou，Sichuan646000,China;3.CollegeofTraditionalChineseMedicine,LuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China;4.StateKeyLaboratoryofBiotherapy，SichuanUniversityWestChinaHospital,Chengdu,Sichuan610041,China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the effect of imatinib in improving myocardial fibrosis in uremic rats through regulating the expression of PDGFRα.MethodsSeventy two rats were divided into three groups,which were Sham group,5/6 group and 5/6+I group.All The rats in 5/6 group underwent the 5/6 nephrectomy and the rats in 5/6+I group were given imatinib by gavage after the operation of 5/6 nephrectomy.Hearts were harvested for HE and Sirius red staining at 8 weeks post surgery.The expression of PDGFRα was assessed with immunohistological staining.The real-time PCR was employed to detect the PDGFRα mRNA level in hear samples.ResultsThe urine protein,Scr,BUN of the 5/6 group and 5/6+I group were higher than that of Sham group(P<0.01).The myocardial pathological score in Sham group was significantly lower than that of 5/6 group (P<0.01),and the score in 5/6+I group was significantly lower than that of 5/6 group (P<0.01).The collagen volume fraction (CVF) in 5/6 group was significantly higher than that in Sham group (P<0.01).And the CVF in 5/6+I group was higher than that in Sham group (P<0.05),but lower than that of 5/6 group (P<0.05).The expression ratio of PDGFRα mRNA and staining rate in 5/6 group and 5/6+I group were both much higher than that in Sham group (P<0.01),and the expression in 5/6+I group was significantly lower than that in 5/6 group (P<0.05).ConclusionThese data suggest that the tyrosine kinase inhibitor imatinib reduces heart injury and attenuates myocardial fibrosis in uremic rat by mechanisms associated with the inhibition of the expression of PDGFRα.

[Key words]cardiomyopathies;myocardium;fibrosis;imatinib;uremic cardiomyopathy;PDGFR

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.008

*基金項目：國家自然科學基金項目(81170667)；四川省科技廳項目(2011JTD0014、2013CDLZ-S20、14JC01503-LH48)；瀘州市科技廳項目[2015-R-55(8/16)]。

作者簡介：馬欣(1989-)，碩士，主要從事慢性腎臟疾病的相關研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:junmingfan@163.com。

[中圖分類號]R542.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)03-0313-04

(收稿日期：2015-08-18修回日期：2015-10-10)