基于共聚焦顯微拉曼光譜的毛竹細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分研究

李曉麗，周斌雄，張 怡，姚炎明，何 勇*

1. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058 2. 浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院茶學(xué)系，浙江 杭州 310058 3. 浙江大學(xué)港口、海岸及近海工程研究所，浙江 杭州 310058

基于共聚焦顯微拉曼光譜的毛竹細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分研究

李曉麗1，周斌雄1，張 怡2，姚炎明3，何 勇1*

1. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058 2. 浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院茶學(xué)系，浙江 杭州 310058 3. 浙江大學(xué)港口、海岸及近海工程研究所，浙江 杭州 310058

采用共聚焦顯微拉曼光譜對毛竹薄壁細(xì)胞、薄壁纖維過渡細(xì)胞和纖維細(xì)胞進(jìn)行研究。通過構(gòu)建偏最小二乘(PLS)定量區(qū)分模型來對這三種細(xì)胞中的差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該區(qū)分模型的建模和交互驗(yàn)證決定系數(shù)(R2)分別為0.810和0.800，均方根誤差(RMSE)分別為0.323和0.332。根據(jù)這一模型的回歸系數(shù)，發(fā)現(xiàn)三種細(xì)胞的區(qū)別主要體現(xiàn)在1 095，1 319和1 636 cm-1三個波數(shù)，這三個波數(shù)分別為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的指紋特征峰。以這三個波數(shù)為自變量建立多元線性回歸(MLR)模型，該回歸模型的建模和交互驗(yàn)證決定系數(shù)(R2)分別為0.644和0.643，均方根誤差(RMSE)分別為0.442和0.443，表明三種細(xì)胞在這三個波數(shù)處存在明顯的差異。對小波變換基線消除后的拉曼光譜信號進(jìn)行化學(xué)成像分析，結(jié)果顯示，纖維素微纖維與纖維軸成一個很大的角度，這一結(jié)構(gòu)有利于提高細(xì)胞的彈性模量和硬度。半纖維素和纖維素微纖維通過氫鍵相連，并在范德華力的作用下緊密地結(jié)合在一起，因此在拉曼化學(xué)成像中可以看到半纖維素和纖維素有相似的分布規(guī)律。三種細(xì)胞的細(xì)胞角和胞間層都高度的木質(zhì)化，從細(xì)胞壁外層到內(nèi)層木質(zhì)化程度逐漸降低，表明細(xì)胞壁的木質(zhì)化從細(xì)胞角和胞間層開始，且木質(zhì)化程度并不完全。

毛竹； 纖維細(xì)胞； 薄壁細(xì)胞； 共聚焦顯微拉曼光譜； 小波變換

引 言

中國是世界上竹類資源最多，分布最廣的國家之一。隨著木材資源的匱乏，竹材成為造紙、紡織和板材的重要原材料。為了更好、更有效地利用竹材，需要對毛竹的結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行更深入的研究[1]。

竹子是單子葉植物，能夠快速地伸長，卻缺少維管束形成層，不存在二次增厚過程，這造成了竹稈的細(xì)長和中空[2]。和木材相比，竹材的強(qiáng)度更高、韌性更好、硬度更大，這些特性主要是由分散在傳輸單元周圍纖維帽中的纖維決定的。

Zou[3]對毛竹纖維進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)纖維由直徑在21～198 nm之間的鵝卵石般的纖維素顆粒構(gòu)成，這使毛竹變得柔軟、不易碎。Wang[4]運(yùn)用拉曼成像技術(shù)和納米壓痕技術(shù)對毛竹維管束區(qū)域進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)毛竹纖維的纖維素纖維絲幾乎都是軸向的，這增大了纖維彈性模量的臨界閾值，有助于提高細(xì)長毛竹莖部的抗彎性。然而，還沒有學(xué)者通過毛竹內(nèi)部細(xì)胞的差異，來對毛竹纖維的成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。

共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)是拉曼光譜分析技術(shù)與顯微分析技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，能對細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行原位、無損的檢測，避免了傳統(tǒng)化學(xué)檢測方法對組織結(jié)構(gòu)的破壞[5]?；诶庾V的化學(xué)成像技術(shù)，能夠在原始狀態(tài)下，直接顯示細(xì)胞中的化學(xué)信息[6]。目前，這一方法被廣泛地運(yùn)用于植物細(xì)胞的成分和結(jié)構(gòu)的研究中[7]。

利用拉曼光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法，對毛竹薄壁細(xì)胞(PAC)、薄壁纖維過渡細(xì)胞(TC)和纖維細(xì)胞(FC)進(jìn)行定量區(qū)分，來探究這三種組織在成分和結(jié)構(gòu)上的差異； 并通過回歸系數(shù)分析，探索造成這三種細(xì)胞差異的主要成分。然后運(yùn)用小波變換方法去除拉曼光譜中熒光背景的干擾，并基于小波重構(gòu)信號進(jìn)行化學(xué)成像分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 植物材料和標(biāo)準(zhǔn)品

毛竹試材采自浙江省麗水市景寧畬族自治縣毛垟村，地處東經(jīng)119°23′，北緯27°43′，海拔325 m； 屬亞熱帶季風(fēng)氣候，溫暖濕潤、雨量充沛、四季分明。取1年生毛竹1株，截取基部起第二個竹節(jié)，風(fēng)干，自竹節(jié)頂部向下1/3處向下取1 cm，并將其去除竹青和竹黃，將竹中部分用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)沿橫向切成10 μm的小薄片，置于載玻片上，滴上一滴清水，再蓋上蓋玻片，供拉曼光譜采集使用。

阿魏酸(Ferulic acid)，別名 反式-4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，購于sigma公司，產(chǎn)品編號128708。對香豆酸(p-Coumaric acid)，別名反式對羥基肉桂酸，購于sigma公司，產(chǎn)品編號C9008。

1.2 拉曼光譜采集

采用雷尼紹共聚焦顯微拉曼光譜儀(in Via-Reflex 532/ XYZ)進(jìn)行拉曼光譜采集。將制好的毛竹切片固定在顯微拉曼光譜儀物鏡下方載物臺上，激光束通過20X的物鏡聚焦到樣本的表面。運(yùn)用“WIRE”軟件進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，設(shè)置曝光時(shí)間2 s，激光強(qiáng)度是50 mV，累計(jì)次數(shù)2次，拉曼光譜采集范圍為229.6～2 803.6 cm-1，整個實(shí)驗(yàn)過程都在恒溫(約25 ℃)條件下進(jìn)行。

運(yùn)用“WiRE”軟件進(jìn)行圖像采集區(qū)域設(shè)定。用矩形來選擇掃描區(qū)域，設(shè)定掃描步長為1.5 μm，以獲得高分辨率的拉曼光譜成像。圖1(a)是5X物鏡下的毛竹維管束組織，包括了用于光譜采集的三種細(xì)胞區(qū)域，其中黑色方框內(nèi)為PAC，紅色方框內(nèi)為TC，藍(lán)色方框內(nèi)為FC。圖1(b)是20X物鏡下的PAC的掃描區(qū)域，包含51×24矩形區(qū)域的1 224個點(diǎn)； 圖1(c)是20X物鏡下的TC的掃描區(qū)域，包含51×20矩形區(qū)域的1020個點(diǎn)； 圖1(d)是20X物鏡下的是FC的掃描區(qū)域，包含25×19矩形區(qū)域的475個點(diǎn)。

Fig.1 (a) Vasculer bundle of moso bamboo including parenchyma cell (PAC), transition tissue between parenchyma cell and fiber cell (TC) and fibre cell (FC); (b) Enlarged view of PAC; (c) Enlarged view of TC; (d) Enlarged view of FC

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Unscrambler化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件包對三種細(xì)胞共2 719個樣本的拉曼光譜曲線進(jìn)行定量區(qū)分，PAC，TC和FC的類別屬性分別設(shè)定為1，2和3，用偏最小二乘回歸模型(PLS)和交互驗(yàn)證方式建立定量區(qū)分模型[8]。篩出特征波數(shù)為自變量，以三種細(xì)胞的類別屬性為因變量，建立多元線性回歸模型(MLR)[9]。PLS和MLR的模型性能主要通過決定系數(shù)和均方根誤差來評價(jià)，決定系數(shù)越高，均方根誤差越低，表明模型的性能越好。

2 結(jié)果與討論

2.1 背景信號的消除和拉曼光譜的分析

本實(shí)驗(yàn)中背景信號主要是由載玻片和蓋玻片引起的，圖2中背景信號即是不包括樣本的載玻片和蓋玻片的拉曼響應(yīng)特性，樣本信號是以薄壁細(xì)胞為例的1 224個樣本的平均拉曼光譜譜線。從圖2(a)背景信號和樣本信號的對比中可以看到，樣本信號主要在波數(shù)800～1 750 cm-1范圍有明顯的峰值，將其放大后如圖2(b)所示。從圖2(b)中可以看到，樣本信號和背景信號在波數(shù)1 456～1 477和1 513～1 544 cm-1范圍存在波峰重合，這些波峰會影響定量區(qū)分模型的區(qū)分結(jié)果，需要通過去除含有相同峰值的區(qū)域來消除背景信號的干擾[4]，因此將這些波段剔除后再進(jìn)行定量分析。

Fig.2 Raman spectra of sample and background in full-range (a) and enlarged (b) graph

從圖2(b)中可以發(fā)現(xiàn)，樣本在波數(shù)1 179，1 608和1 636 cm-1處有非常明顯的拉曼峰。Heitner[10]指出毛竹木質(zhì)素的拉曼峰值主要位于波數(shù)1 604和1 630 cm-1處，主要是由自由的和酯化了的酚醛樹脂引起的。實(shí)驗(yàn)中分別對阿魏酸和對香豆酸的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行拉曼光譜采集，將采集到的光譜以最大值為參照進(jìn)行歸一化處理，處理后的結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看到，PAC和阿魏酸以及對香豆酸在1 179，1 608和1 636 cm-1三個波數(shù)附近都有明顯的峰值，這與Cyril的結(jié)果一致，表明樣本中1 179，1 608和1 636 cm-1三個波數(shù)屬于包含酚酸的木質(zhì)素彎曲振動。同時(shí)，樣本在波數(shù)1 095和1 319 cm-1處也有明顯的拉曼峰。Edwards[11]研究發(fā)現(xiàn)1 095 cm-1是屬于纖維素中C—O—C的彎曲振動。Himmelsbach[12]對買自Megazyme的木葡聚糖和阿拉伯聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了拉曼光譜掃描，發(fā)現(xiàn)木葡聚糖分子和阿拉伯聚糖分子在1 319 cm-1處有明顯的拉曼峰，這一波數(shù)屬于半纖維素中OH/CH和CH/CH2的彎曲振動。因此，樣本中1 095和1 319 cm-1兩個波數(shù)分別屬于纖維素和半纖維素的彎曲振動。

Fig.3 Normalized raman spectra: (a) ferulic acid, (b)p-Coumaric acid, (c) parenchyma cell (PAC)

2.2 偏最小二乘定量區(qū)分和多元線性回歸模型

為了獲取PAC，TC和FC的差異，對三種細(xì)胞進(jìn)行定量區(qū)分，對三種細(xì)胞的樣本在波數(shù)800～1 455，1 478～1 512和1 545～1 750 cm-1范圍內(nèi)的拉曼光譜進(jìn)行偏最小二乘回歸分析。分析結(jié)果表明，三種細(xì)胞區(qū)分模型的建模和交互驗(yàn)證決定系數(shù)(R2)分別為0.810和0.800，均方根誤差(RMSE)分別為0.323和0.332，其中建模和交互驗(yàn)證的散點(diǎn)分布圖如圖4所示。

Fig.4 Calibration and validation results of the PLS

為了進(jìn)一步分析對于區(qū)分起重要作用的波數(shù)，對該回歸模型的回歸系數(shù)進(jìn)行分析，模型的回歸系數(shù)越大，表明這一回歸系數(shù)對應(yīng)的拉曼峰值對于區(qū)分越重要[13-14]。因此，通過對回歸系數(shù)的分析，可以得到對于區(qū)分PAC，TC和FC的重要拉曼峰值，同時(shí)由于拉曼具有指紋特征響應(yīng)性，所以根據(jù)這些峰值可以得到影響這三種細(xì)胞差異的主要化學(xué)成分。圖5顯示了PLS模型的回歸曲線，從中可以看到在波數(shù)1 095，1 319和1 636 cm-1處有很高的系數(shù)，表明三種細(xì)胞在這三處拉曼峰值有明顯的差異。為了進(jìn)一步評估這三個波數(shù)對于區(qū)分模型的作用，以波數(shù)1 095，1 319和1 636 cm-1為自變量建立MLR模型，其建模和交互驗(yàn)證的散點(diǎn)分布如圖6所示。回歸模型的建模和交互驗(yàn)證決定系數(shù)(R2)分別為0.644和0.643，均方根誤差(RMSE)分別為0.442和0.443，表明這三種細(xì)胞在波數(shù)1 095，1 319和1 636 cm-1處存在明顯的差異。

Fig.5 Regression coefficient of the PLS

Fig.6 Calibration and validation results of the MLR

2.3 小波變換

拉曼光譜中存在明顯的熒光和噪聲干擾，而小波變換能夠有效地去除這些干擾，目前已被用于拉曼光譜的處理。運(yùn)用Matlab 小波分析工具箱，采用db1小波基函數(shù)分別對三種細(xì)胞共2 719個拉曼譜線進(jìn)行離散小波變換(DWT)和離散小波系數(shù)重構(gòu)(IDWT)。以PAC樣本為例的小波分解和重構(gòu)結(jié)果如圖7所示。圖7(a)顯示小波處理前的光譜信號，從中可以看到明顯的熒光信號。圖7(b), (c), (d)分別表示一、二和三水平的高頻信號，圖7(e)表示三水平低頻信號(a3)。通過圖7(b), (c), (d), (e)的對比可以看到，d3在保留了PAC光譜中的重要峰值信息的同時(shí)排除了熒光信號的干擾。對d3進(jìn)行小波系數(shù)重構(gòu)得到D3，結(jié)果如圖7(f)所示。

2.4 毛竹成分的拉曼光譜成像分析

通過PLS模型和MLR模型，已經(jīng)得到了區(qū)分三種細(xì)胞的特征波數(shù)。為了分析這三個特征波數(shù)對應(yīng)的化學(xué)成分在組織中的空間分布情況，對PAC，TC和FC分別在波數(shù)1 095，1 319和1 636 cm-1處進(jìn)行積分成像。將三水平分解重構(gòu)后(D3)的光譜數(shù)據(jù)用于拉曼化學(xué)成像，成像結(jié)果如圖8所示。

Fig.7 DWT and IDWT of parenchyma cell (PAC)

從圖8中光學(xué)顯微鏡圖和拉曼化學(xué)成像圖的對比中可以看出，拉曼化學(xué)成像能夠?qū)⒛：娘@微圖像[特別是圖8(i)]清晰化，并能清晰地顯示細(xì)胞中化學(xué)成分的分布。從圖8(b)，(f)，(j)中細(xì)胞的胞腔內(nèi)可以看到纖維素的存在，這主要是因?yàn)槔w維素微纖維與纖維軸形成了一個很大的角度，這一結(jié)構(gòu)極大地提高了細(xì)胞的彈性模量和硬度[4]。圖8(c)，(g)，(k)顯示半纖維素在細(xì)胞中的分布，這一分布與圖8(b)，(f)，(j)中纖維素的分布相似，這主要是因?yàn)榘肜w維素和纖維素微纖維通過氫鍵相連，并在范德華力的作用下緊密地結(jié)合在一起。從圖8(d)，(h)，(i)中可以看到木質(zhì)素在細(xì)胞中的分布，其中細(xì)胞的細(xì)胞角(CC)和胞間層(CML)呈現(xiàn)高度的木質(zhì)化，而且從細(xì)胞壁外層到內(nèi)層木質(zhì)化程度逐漸降低，這表明細(xì)胞壁的木質(zhì)化從細(xì)胞角和胞間層開始，且木質(zhì)化程度并不完全。

3 結(jié) 論

采用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)研究了毛竹PAC，TC和FC的差別，研究表明拉曼光譜能夠?qū)γ竦募?xì)胞成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行無損檢測，并良好地區(qū)分這三種細(xì)胞。毛竹三種細(xì)胞的差異主要體現(xiàn)在波數(shù)1 095，1 319和1 636 cm-1處的拉曼峰值，對應(yīng)的物質(zhì)為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。以這三個拉曼峰值進(jìn)行拉曼光譜成像，發(fā)現(xiàn)毛竹維素微纖維與纖維軸構(gòu)成一個很大的角度，這極大地提高了細(xì)胞的彈性模量和硬度。本工作將PLS和MLR的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和拉曼化學(xué)成像技術(shù)結(jié)合起來，有效地分析出三種毛竹細(xì)胞在化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)上的差異。

Fig.8 Optical microscope images of PAC (a), TNC (e) and TKC (i)； Raman chemical images of cells: (b), (f) and (j), intensity of pectin band of 1 095 cm-1; (c), (g) and (k), intensity of the Hemicellulose band of 1 319 cm-1; (d), (h) and (l), intensity of the Lignin band of 1 636 cm-1

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*Corresponding author

Revealing the Cell Structure and Formation of Bamboo with Confocal Raman Microscopy

LI Xiao-li1, ZHOU Bin-xiong1, ZHANG Yi2, YAO Yan-ming3, HE Yong1*

1. College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China 2. Department of Tea Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China 3. Institute of Harbor Coastal and Nearshore Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China

Parenchyma cell (PAC), transition tissue between parenchyma cell and fiber cell (TC) and fibre cell (FC) of bamboo were studied by confocal Raman microscopy in this paper. Partial least squares regression was applied to establish a quantitative differentiation model for the three types of cells. The result showed that the determination coefficients (R2) of calibration and validation were respectively 0.810 and 0.800, and the root mean square error (RMSE) were respectively 0.323 and 0.332. What’s more, three raman bands of 1 095, 1 319 and 1 636 cm-1, verified to the characteristic peaks of pectin, hemicellulose and lignin, were found to be the important bands for the differentiation. Subsequently, these three raman bands were used to establish a multiple linear regression (MLR) model, and the determination coefficients(R2) of calibration and validation of the model were respectively 0.644 and 0.643, and the root mean square error (RMSE) were respectively 0.442 and 0.443. This result showed that there existed obvious difference among the three types of cells in these three raman bands. Finally, the raman spectral signal processed by wavelet transform to eliminate baseline were used to chemical imaging analysis. These results showed a rather large microfibril angle between cellulose fibrils and fibre axis, which contributed to higher modulus and hardness of cells. Hemicellulose and cellulose have similar distribution in the raman chemical image, due to the connection of hemicellulose and cellulose microfiber through hydrogen bond and the closely combination under the action of van der Waals force. The cell corners (CC) and compound middle lamella (CML) were heavily lignified, and a gradual decrease of lignification from the outer layer to the inner layer of the three cells indicate that lignification was first occurred at the CC and CML, and the lignification was not fully completed.

Bamboo； Fibre cell; Parenchyma cell; Confocal Raman microscopy; Wavelet Transform

Nov. 19, 2014; accepted Mar. 24, 2015)

2014-11-19，

2015-03-24

2014年度浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014C32091)，國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(61201073，31471417)資助

李曉麗，女，1982年生, 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院副教授 e-mail: xiaolili@zju.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: yhe@zju.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0413-06