膠體金核殼型沙丁胺醇分子印跡聚合物的光譜特征分析

任慧鵬，管毓渝，戴榮華，劉國(guó)艷，柴春彥

上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海 200240

膠體金核殼型沙丁胺醇分子印跡聚合物的光譜特征分析

任慧鵬，管毓渝，戴榮華，劉國(guó)艷，柴春彥*

上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海 200240

沙丁胺醇； 核殼型分子印跡物； 紅外光譜； 掃描電鏡； 快速檢測(cè)

引 言

沙丁胺醇(salbutamol, SAL), 是眾多非天然β-受體激動(dòng)劑中的一種，促進(jìn)動(dòng)物肌肉組織的生長(zhǎng)，進(jìn)而提高瘦肉率[1]。自2002年起農(nóng)業(yè)部嚴(yán)令禁止在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中使用SAL, 但仍有一些企業(yè)將SAL作為鹽酸克倫特羅的替代品違法使用。濫用SAL會(huì)造成其在畜禽產(chǎn)品中殘留過(guò)量，進(jìn)而對(duì)消費(fèi)者的安全和健康造成很大的威脅。建立完善的檢測(cè)方法是控制SAL濫用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前，檢測(cè)SAL的方法主要有HPLC[2]，LC-MS[3]以及GC-MS[4]等色譜分析技術(shù)，也有基于免疫學(xué)技術(shù)的ELISA方法等[5]。其中GC-MS是檢測(cè)SAL的確證性方法，應(yīng)用最為普遍[6]。色譜法和免疫學(xué)技術(shù)均需要對(duì)樣品進(jìn)行繁瑣的前處理，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需要專門的儀器設(shè)備和專業(yè)分析人員才能完成。目前，食品安全控制機(jī)構(gòu)需要檢測(cè)的SAL樣品數(shù)量龐大，亟需高效并適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的新技術(shù)和新方法。而將傳感技術(shù)與分子印跡技術(shù)結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)SAL的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[7-8]。本工作采用沉淀聚合的方法合成常規(guī)SAL-MIPs，并以膠體金粒子為引發(fā)核制備核殼型SAL-MIPs。通過(guò)紫外和紅外光譜等技術(shù)來(lái)分析它們的光譜學(xué)特征，以評(píng)價(jià)兩種印跡物對(duì)目標(biāo)分子的特異性識(shí)別能力，以期為建立基于分子印跡技術(shù)快速檢測(cè)SAL的傳感方法奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑： 沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品(SAL)購(gòu)于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫研究院； 氯金酸、檸檬酸鈉、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、二甲亞砜(DMSO)等試劑均為分析純，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)； 實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

儀器： EQUINOX-55 傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet6700，ThermoFishe, American), 色散型顯微拉曼光譜儀(SENTEARA R200, Bruker, Germany)，UV1800PC紫外-可見分光光度計(jì)( Shimadzu, Japan), XMTD-204 電熱恒溫水浴鍋(上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司), RS-120 超聲波儀(上海瑞勝儀器儀表有限公司)，索氏提取器( 泰州市科創(chuàng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 常規(guī)沙丁胺醇分子印跡聚合物(MIPs)和非印跡聚合物(NIPs)的制備

取SAL 0.239 3 g、MAA 0.258 3 g溶于2.34 mL DMSO中超聲15 min并放置4 h進(jìn)行預(yù)聚合。加入EGDMA 3.772 0 g, AIBN 0.032 8 g, 超聲混合均勻?；旌弦哼M(jìn)行氮吹排氧15 min, 完全密封后80 ℃ 水浴24 h, 得白色堅(jiān)硬致密聚合物。將該聚合物置于研缽充分研磨, 用丙酮沖洗沉降，過(guò)濾得到粒徑均勻的粉末狀物質(zhì)。將粉末中丙酮蒸干，放置于索氏提取器底部, 在下端固定在水浴鍋中的燒瓶里加入體積比為9∶1的甲醇-乙酸溶液洗脫48 h。用甲醇洗去乙酸, 60 ℃干燥后得到MIPs。

制備NIPs時(shí)不加入作為模板分子的SAL, 其他步驟與制備MIPs相同。

1.3 膠體金核殼型沙丁胺醇分子印跡聚合物(MIPs)和非印跡聚合物(NIPs)的制備

1.3.1 金溶膠的制備

將1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸和25 mL蒸餾水加入圓底燒瓶，燒瓶加熱并在上面連接冷凝裝置。待燒瓶中液體沸騰時(shí)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸檬酸溶液2.85 mL，繼續(xù)加熱。自溶液從黑色變?yōu)橥该鞯募t色時(shí)開始計(jì)時(shí)。計(jì)時(shí)15 min后取下燒瓶。將最終得到紅色透明的金溶膠溶液置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 膠體金核殼型SAL分子印跡聚合物的制備

取119 mL金溶膠于圓底燒瓶, 加入適量酒精再加入24 mg SAL, 室溫震蕩30 min。再加入25.8 mg MAA，234 μL DMSO，將上述混合物超聲30 min使分散均勻, 放置4 h進(jìn)行預(yù)聚合。在預(yù)聚合液中加入396.4 mg EGDMA, 3.28 mg AIBN。超聲混合至溶液分布均一后, 充氮排氧15 min。將圓底燒瓶密閉，置于60 ℃水浴鍋中24 h得淺藍(lán)色絮狀懸濁液。將液體過(guò)濾后獲得的絮狀沉淀烘干。用濾紙將烘干后的物質(zhì)包封嚴(yán)實(shí), 置于索氏提取器底部, 以甲醇∶乙酸(V∶V=9∶1)在提取器中80 ℃洗脫48 h。取出洗脫后的粉末，用甲醇洗滌除去乙酸，再次烘干即得膠體金核殼型SAL-MIPs，將該印跡物放在4 ℃冰箱保存。

非膠體金核殼型SAL-MIPs制備除了不加SAL外，其他操作與膠體金核殼型沙丁胺醇印跡聚合物完全相同。

1.4 兩種沙丁胺醇印跡聚合物的形貌表征

用低真空超高分辨率掃描電鏡(LV-SEM)分別分析兩種印跡物的微觀形貌。掃描電壓： 5.0 kV； 放大倍數(shù)： 10 000 倍，掃描模式： vCD。

1.5 紫外吸收光譜分析

1.5.1 SAL(模板分子)與MAA(功能單體)預(yù)聚合液的紫外吸收光譜分析

各取1 mL濃度為0.1 mmol·L-1SAL-二甲亞砜溶液，置于編號(hào)為1～4的PVC管中。在1，2，3，4號(hào)管中分別加入濃度為的0, 0.2, 0.6和1.0 mmol·L-1的MAA-二甲亞砜溶液各1 mL。超聲處理使溶液混合充分, 靜置預(yù)聚合4 h。對(duì)SAL-MAA混合溶液進(jìn)行紫外吸收測(cè)定，參比溶液未加SAL，其他處理相同。

1.5.2 金溶膠的紫外光譜分析

取1 mL制備成功的金溶膠，以蒸餾水為參照測(cè)定其紫外吸收?qǐng)D譜。

1.6 兩種印跡物的傅里葉紅外光譜分析

確認(rèn)樣品均完全干燥后，參照KBr壓片法，分別取5 mg MIPs，NIPs和膠體金核殼型MIPs進(jìn)行樣品前處理, 在400～4 200 cm- 1范圍測(cè)定紅外光譜。

1.7 兩種印跡物拉曼光譜分析

取10 mg洗脫后的MIPs和NIPs及膠體金核殼型MIPs, 在0～3 500 cm- 1范圍內(nèi)，785 nm激發(fā)波長(zhǎng)處進(jìn)行共聚焦拉曼檢測(cè)。

Fig.1 Scanning electron microscopy (SEM) images of NIPs (a) and MIPs (b), ×10 000

Fig.2 Scanning electron microscopy (SEM) images of karyotype of colloidal gold MIPs without eluting (a) and eluted karyotype of colloidal gold MIPs (b), ×10 000

2 結(jié)果與討論

2.1 沙丁胺醇印跡聚合物的形貌表征

沙丁胺醇印跡聚合物的形貌表征如圖1和圖2所示。

2.2 沙丁胺醇與甲基丙烯酸預(yù)聚合液的紫外吸收光譜特征

沙丁胺醇(模板分子)與甲基丙烯酸(功能單體)預(yù)聚合液的紫外吸收光譜如圖3所示。

Fig.3 UV adsorption spectra of salbutamol (template molecule) and MAA (functional monomers)system in DMSO solution

a0(sal)=0.1 mmol·L-1;

b0(MA)/mmol·L-1=a: 1.0;b: 0.6;c: 0.2;d: 0

SAL分子是由帶羥基、羥甲基的苯環(huán)和叔丁氨基組成的醇類, 其共軛系統(tǒng)的特征吸收峰在275 nm附近。從紫外吸收光譜的特征分析SAL與MAA的相互作用, 計(jì)算SAL和MAA形成的主客體配合物的配位比和結(jié)合常數(shù)。由圖3可見, 當(dāng)溶劑中MAA濃度逐漸升高時(shí), SAL分子的吸收波長(zhǎng)也隨之出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，最大吸收波長(zhǎng)數(shù)值不斷增大，在圖中表現(xiàn)為吸收峰向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向平移。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是MAA作為質(zhì)子供體，跟SAL的生色基團(tuán)發(fā)生作用形成氫鍵。SAL的最大吸收波長(zhǎng)變化產(chǎn)生部分能量損失，這些能量損失參與氫鍵形成。

Fig.4 UV adsorption spectra of colloidal gold

設(shè)主體SAL的濃度為a0, 客體MAA濃度為b0, 化學(xué)配位比為n, 則結(jié)合反應(yīng)如下

sal+nMAA=sal[MAA]n

(1)

K={sal[MAA]n}/[sal][MAA]n

(2)

根據(jù)物料平衡[sal]+{sal[MAA]n}=a0

[MAA]+{sal[MAA]n}=b0

(3)

因?yàn)閎0遠(yuǎn)大于a0, 可忽略{sal[MAA]n}, 所以

[MAA]≈b0

(4)

將式(3)和式(4)代入式(2)得

(5)

假設(shè)溶液中發(fā)生吸收的物質(zhì)只有sal與sal[MAA]n, 將SAL和配合物的摩爾吸收系數(shù)分別設(shè)為ε1和ε2, 由Lamber-Beer定律可知總吸光度為

A=ε1l[sal]+ε2l{sal[MAA]n}

=ε1l(a0-{sal[MAA]n}) +ε2l{sal[MAA]n}

=(ε2-ε1)l{sal[MAA]n}+ε1la0

(6)

令A(yù)0=ε1la0, 則吸光度的變化為

ΔA=A-A0=(ε2-ε1)l{sal[MAA]n}=Δεl{sal[MAA]n}

(7)

將式(7)代入式(5)得

(8)

從圖4膠體金的紫外吸收光譜可以看到，金原子的紫外特征吸收峰非常明顯，在512 nm附近?？芍鹪泳哂蟹€(wěn)定優(yōu)良的光譜學(xué)特征，適合做引發(fā)核來(lái)制備更疏松、吸附能力更好的核殼型分子印跡物。

2.3 印跡聚合物及相關(guān)物質(zhì)化學(xué)基團(tuán)的紅外光譜特征

Fig.5 IR spectra of salbutamol

Fig.6 IR spectra of MIP without eluting a and salbutamol b

Fig.7 IR spectra of EGDMA a，MIPs without eluting b, MA c

2.4 MIPS和NIPS拉曼光譜特征

Fig.8 IR spectra of eluted MIPs a and NIPs b

Fig.9 IR spectra of karyotype of colloidal gold MIPs without eluting a and eluted MIPs b

圖11為已洗脫和未洗脫膠體金核殼型MIPs的拉曼光譜，可以看到它們之間存在明顯差異。未洗脫的核殼型MIPs中振動(dòng)模增加，使幾乎所有的特征峰峰寬都顯著增加，最終疊加為圖中所示。當(dāng)把SAL去除掉以后，各化學(xué)鍵恢復(fù)正常，峰型和峰寬也與紅外光譜峰對(duì)應(yīng)。由此可知合成膠體金核殼型MIPs的過(guò)程與合成普通MIPs的過(guò)程相比，前者中各化合物在形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時(shí)大部分化學(xué)鍵發(fā)生了顯著變形，這也是最終形成松散結(jié)構(gòu)的另一影響因素。

在實(shí)驗(yàn)中使用本體聚合技術(shù)，順利合成SAL-MIPs。此方法操作方便，易于普及。此外，SAL洗脫簡(jiǎn)單, 表明預(yù)聚合液中SAL與MA形成容易洗脫的1∶1型氫鍵主客體配合物，而結(jié)合常數(shù)K=-0.245×106L2·mol-2又說(shuō)明它們以相對(duì)穩(wěn)定的非共價(jià)方式結(jié)合, 這也驗(yàn)證了相關(guān)報(bào)道中的結(jié)論[11]。

Fig.11 Raman spectrum of karyotype of colloidal gold MIPs without elutingaand eluted karyotype of colloidal gold MIPsb

拉曼光譜圖10中MIPs和NIPs中峰型基本相同但強(qiáng)度不同，是因?yàn)閮烧呔嬖谖辗灞容^明顯的相似官能團(tuán)。但是，SAL分子中叔丁氨基的N原子通過(guò)氫鍵與MAA的羧基結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生識(shí)別位點(diǎn)。待SAL與交聯(lián)劑EGDMA、引發(fā)劑AIBN按特定比例混合后, 聚合物中就會(huì)出現(xiàn)一些被交聯(lián)固定的具有特異性識(shí)別作用的位點(diǎn)[12]。在印跡聚合物加熱洗脫的過(guò)程中，作為模板分子的SAL被洗脫，在印跡聚合物中留下了一定尺寸的空穴結(jié)構(gòu)，這些空穴的大小形狀、化學(xué)結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生作用的位置等都可與SAL匹配，這是該印跡聚合物對(duì)SAL有特異選擇性的原因之一[13]。另外, 印跡聚合物洗脫后形成的孔穴中，一部分分布在其中的官能團(tuán)排列比較特異，這些官能團(tuán)與SAL之間存在氫鍵非共價(jià)結(jié)合作用，產(chǎn)生特異識(shí)別SAL的作用位點(diǎn)[14]。氫鍵產(chǎn)生的作用力比靜電產(chǎn)生的作用力更強(qiáng)，因此具有較強(qiáng)的結(jié)合能力； 而相對(duì)于共價(jià)鍵，氫鍵的結(jié)合能力又比較弱，所以模板分子更容易被去除，分子印跡聚合物的選擇作用也因而提高。以氫鍵等非共價(jià)類型結(jié)合的MIP適應(yīng)范圍比較廣泛[15]，生物相容性也比較好，選擇性優(yōu)良，其識(shí)別性能也具有較大的應(yīng)用潛力。

膠體金的生化性質(zhì)和物化性質(zhì)都較為獨(dú)特, 其中的金原子很容易使化合物以它為核包繞絡(luò)合形成分子印跡物。由于此類金核的存在，分子印跡物不斷向外延展生長(zhǎng)，最后形成松散、表面均一、空穴較多的結(jié)構(gòu)。在這種結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，再結(jié)合普通分子印跡物的生物相容性和選擇性等優(yōu)點(diǎn)，膠體金核殼型分子印跡物將在生物傳感檢測(cè)方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

對(duì)SAL的分子印跡物(MIPs)進(jìn)行光譜分析結(jié)果表明SAL和MAA生成的聚合物為主客體配合物類型，結(jié)合方式為氫鍵鍵合。將MIPs洗脫模板分子后留下含有特定類型官能團(tuán)，化學(xué)結(jié)構(gòu)及空間分布均與SAL高度匹配的空穴結(jié)構(gòu), 可與待測(cè)液中的目標(biāo)分子SAL發(fā)生特異識(shí)別和專一結(jié)合作用。以金溶膠中的納米金為核形成的膠體金核型分子印跡物不但具有普通分子印跡物的各種優(yōu)點(diǎn)，其本身也有更加疏松的結(jié)構(gòu)和更多產(chǎn)生特異識(shí)別作用的空穴。這樣的疏松結(jié)構(gòu)在吸附時(shí)能夠提供更大的接觸面積，更有利于目標(biāo)分子與空穴中對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)結(jié)合，從而彌補(bǔ)了普通分子印跡物在高濃度樣品溶液中結(jié)合能力有限的問(wèn)題，因而其具有更優(yōu)良的檢測(cè)效能。這也為建立基于分子印跡技術(shù)的快速檢測(cè)SAL新方法奠定了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

[1] JIANG Chen-lu，LI Lin(姜琛璐，李 林). Modern Preventive Medicine(現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué))，2013, 2: 227.

[2] LI Wei-hong, DAI Ting-can, XIONG Yan(李偉紅, 戴廷燦, 熊 艷). Acta Agriculturae Jiangxi(江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)), 2007, 19(3): 102.

[3] Lee H B, Sarafin K, Peart T E. J. Chromatogr. A, 2007, 1148: 158.

[4] Bocca B, Fiori M, Cartoni C, et al. Journal of AOAC International, 2003, 86: 8

[5] SUN Hai-xin, LING Hong-li, WANG Lei, et al(孫海新，凌紅麗，王 雷，等). Chinese Journal of Animal Quarantine(中國(guó)動(dòng)物檢疫)，2009, 12: 44.

[6] CHEN Xiao-shui, HOU Hong-wei, BIAN Zhao-yang, et al(陳曉水，侯宏衛(wèi)，邊照陽(yáng)，等). Journal of Chinese Mass Spectrometry Society(質(zhì)譜學(xué)報(bào))，2013, 34(5): 308.

[7] QI Yu-bing，LIU Ying，SONG Qi-jun(齊玉冰，劉 瑛，宋啟軍，等). Chinese Journal of Analytical Chemistry(分析化學(xué))，2011, 39: 1053.

[8] Xu Z X, Fang G Z, Wang S. Food Chemistry, 2010, 119(2): 845.

[9] Yang J, Zhu X L, Cai J B, et al. Anal. Bioanal. Chem., 2006, 384(3): 761.

[10] WEN Li-rong，LI Ming，ZHAO Gui-long(文麗榮，李 明，趙桂龍). Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory(光譜實(shí)驗(yàn)室)，2004, 21(2)： 244.

[11] Qi Liang-deng，Yan Li-li, LI Hua-zhang, et al. Chinese Chemical Letters, 2011, 24: 1351.

[12] ZHANG Jin, XU Lan, WANG Ya-qiong, et al(張 進(jìn)，徐 嵐，王亞瓊，等). Chinese Journal of Analytical Chemistry(分析化學(xué))，2009，37(7)： 1041.

[13] GAO Xia, FAN Jing, WANG Xiao-long，et al(高 霞，樊 靜，王小龍，等). Acta Chimica Sinica(化學(xué)學(xué)報(bào))，2013, 71: 1411.

[14] WANG Ying，LI Nan(王 穎，李 楠). Chemical Industry and Engineering Progress(化工進(jìn)展), 2010, 29(12): 2315.

[15] Mayes A G, Whitcombe M J. Advanced Drug Delivery Reviews, 2005，57: 1742.

Spectroscopic Study of Salbutamol Molecularly Imprinted Polymers

REN Hui-peng, GUAN Yu-yu, DAI Rong-hua, LIU Guo-yan, CHAI Chun-yan*

School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

Salbutamol； Core-shell molecularly imprinted polymers； Infrared spectra； Scanning electron microscopy； Rapid detection

Nov. 24, 2014; accepted Mar. 28, 2015)

2014-11-24，

2015-03-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372344)資助

任慧鵬，女，1990年生，上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院碩士研究生 e-mail: 826665647@qq.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: cychai88@hotmail.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0372-07

*Corresponding author