急性淋巴細胞白血病患兒外周血IL-17、IL-35及T淋巴細胞亞群的變化及意義

王西閣 張曉敏 趙雪蓮 周玉潔 任瑞芳

急性淋巴細胞白血病患兒外周血IL-17、IL-35及T淋巴細胞亞群的變化及意義

王西閣 張曉敏 趙雪蓮 周玉潔 任瑞芳

目的 本研究通過檢測急性淋巴細胞白血病(ALL)患兒外周血中IL-17、IL-35水平及T淋巴細胞亞群表達，探討其在ALL發(fā)病中的作用。方法 選擇141例ALL患兒，其中初診76例(初診組)、治療后完全緩解65例(緩解組)，另選45例健康兒童為對照組。采用流式細胞術(shù)檢測各組患兒

CD 3+T淋巴細胞、CD 4+T淋巴細胞、CD 8+T淋巴細胞的表達，酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-17、IL-35的水平。結(jié)果 IL-17的水平：初診組(8.66±0.95)pg/ mL和緩解組(14.86±1.77)pg/mL均低于對照組(22.85±1.84)pg/mL(P<0.05)；IL-35的水平：初診組(164.72±8.99)pg/mL和緩解組(125.63±8.41) pg/mL均高于對照組(69.07±3.23)pg/mL(P<0.05)；CD 3+T淋巴細胞、CD 4+T淋巴細胞的表達水平：初診組［(60.75±3.16)%、（30.00±2.30）%］和緩解組［（67.31±2.94）%、（34.51±2.44）%］均低于對照組［（69.53±4.12）%、（38.18±2.39）%］(P<0.05)；CD 8+T淋巴細胞的表達水平：初診租（33.32±3.01）%和緩解組（29.54±2.70）%高于對照組(25.87±2.01%)(P<0.05)；初診組與緩解組之間的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CD 4+T淋巴細胞的表達水平與IL-17的水平呈正相關(guān)(r=0.678,P<0.01)，與IL-35的水平呈負相關(guān)(r=-0.688,P<0.01)。結(jié)論 ALL患兒存在不同程度的免疫異常，外周血中IL-17的低表達、IL-35的高表達，可能在ALL的發(fā)病中起重要作用。

急性淋巴細胞白血??；IL-17；IL-35；T淋巴細胞亞群；兒童

急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是指由未分化或分化程度較低的淋巴細胞在骨髓、淋巴結(jié)及脾臟等造血器官內(nèi)無限增殖所致的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，為兒童最常見的惡性腫瘤。研究顯示[2]，惡性腫瘤患者普遍存在免疫功能下降，主要體現(xiàn)在細胞免疫功能方面，且腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與T淋巴細胞亞群有密切聯(lián)系。調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)和輔助性T細胞17(Th 17)是新近發(fā)現(xiàn)的CD 4+T淋巴細胞亞群。Th 17細胞主要通過白介素17(interleukin-17，IL-17)來發(fā)揮作用。白介素35(interleukin-35，IL-35)主要由Tregs分泌，是其發(fā)揮免疫負調(diào)控的主要細胞因子之一。本文將初步探討IL-17、IL-35 及T淋巴細胞亞群在ALL發(fā)病機制中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年1月～2015年4月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院及第一附屬醫(yī)院就診的ALL患兒141例，其中初步確診但未治療的ALL患兒76例為初診組，男46例，女30例，年齡1～14歲，中位年齡6歲；已經(jīng)確診并經(jīng)系統(tǒng)化療達到完全緩解的ALL患兒65例為緩解組，男39例，女26例，年齡2～13歲，中位年齡6歲。診斷標準及化療方案均依據(jù)《小兒急性淋巴細胞白血病診療建議》[3]。另選同期本院兒童保健中心體檢正常的兒童45例作為對照組，男27例，女18例，年齡3～15歲，中位年齡7歲。對照組患兒性別、年齡與初診組、緩解組ALL患兒比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究獲得本院人體試驗委員會批準及家屬的知情同意。

完全緩解的標準為[4]：（1）臨床無白血病細胞浸潤所致的癥狀和體征，生活正?；蚪咏！＃?）血象：Hb≥90 g/L，中性粒細胞絕對值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L。外周血白細胞分類中無白血病細胞。（3）骨髓象：原始淋巴細胞＋幼稚淋巴細胞≤5%，紅細胞及巨核細胞系正常。

1.2 研究方法

1.2.1 標本的采集 初診組及緩解組患兒均于入院未治療前抽取外周靜脈血5mL，對照組為隨機抽取外周靜脈血5mL，其中3mL用EDTA管抗凝，6 h內(nèi)流式細胞術(shù)分析，檢測T淋巴細胞亞群；2 mL置于普通干燥管中，2500 r/min離心10 min，分離血清后，置于-80℃保存。

1.2.2 主要試劑及儀器 C D 4F I T C/C D 8P E/ CD 3PerCP試劑及紅細胞裂解液均購自美國BD公司；IL-17、IL-35的ELISA試劑盒均購自美國R&D公司；酶標儀購自美國伯樂Bio-rad，洗板機購自美國熱電thermo；FACSCalibur型流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測CD 3+T淋巴細胞、CD 4+T淋巴細胞、CD 8+T淋巴細胞 先將流式管進行編號，然后將標本反復(fù)顛倒混勻；先取5μL CD 4FITC/CD 8PE/CD 3PerCP試劑加入到流式管底部，再取20 μL EDTA抗凝全血加入到流式管中，低速震蕩混勻，室溫避光15 min；加入200 μL 1×紅細胞裂解液，室溫避光10 min后上機，采用FACSComp軟件分析檢測。

1.2.4 細胞因子測定 外周血IL-17、IL-35水平的檢測采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，酶標儀檢測450 nm處吸光度值，以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，計算IL-17、IL-35水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。計量資料以“±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，變量間的相關(guān)性分析采用Pearson積矩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血IL-17、IL-35的水平 初診組和緩解組IL-17的水平均低于對照組(P<0.05)，且初診組低于緩解組(P<0.05)；初診組和緩解組IL-35的水平均高于對照組(P<0.05)，且初診組高于緩解組(P<0.05)；各組間的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組外周血IL-17、IL-35水平的比較(x±s,pg/mL)

2.2 T淋巴細胞亞群的水平 初診組和緩解組CD 3+T淋巴細胞、CD 4+T淋巴細胞的表達水平均低于對照組(P<0.05)，CD 8+T淋巴細胞的表達水平高于對照組(P<0.05)，初診組與緩解組之間的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組外周血T淋巴細胞亞群測定結(jié)果的比較±s,%)

表2 各組外周血T淋巴細胞亞群測定結(jié)果的比較±s,%)

注:與對照組比較，aP<0.05；與緩解組比較，bP<0.05

組別例數(shù)CD 3+TCD 4+TCD 8+T對照組4569.53±4.1238.18±2.3925.87±2.01緩解組6567.31±2.94a34.51±2.44a29.54±2.70a初診組7660.75±3.16ab30.00±2.30ab33.32±3.01abF值117.92175.85111.88 P值＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 相關(guān)性分析 ALL患兒外周血CD 4+T淋巴細胞的表達水平與IL-17的水平呈正相關(guān)(r＝0.678,P<0.01)，與IL-35的水平呈負相關(guān)(r＝-0.688,P<0.01)。

3 討論

急性白血病(acute leukemia,AL)占所有兒童惡性腫瘤的25%～35%，根據(jù)骨髓細胞形態(tài)學(xué)分型分為急性淋巴細胞白血病(ALL)和急性髓細胞白血病(AML)，兒童白血病以ALL為主，占60%～70%。其發(fā)病機制包括[5]：“二次打擊”學(xué)說（如：染色體異位形成融合基因、多基因參與的第二次打擊）、免疫因素、腫瘤干細胞等。近期的研究發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性也與白血病的易患性相關(guān)[6]，如葉酸代謝相關(guān)基因、細胞色素P 450和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、苯醌氧化還原酶-1等。此外，研究發(fā)現(xiàn)[7]CASP 8AP 2基因啟動子區(qū)-1189和-1176兩個CpG位點的異常高甲基化可能與兒童ALL的發(fā)病相關(guān)。由于白血病的生物多樣性，其病因及發(fā)病機制也是多因素的。本文主要從免疫因素方面探索兒童ALL的發(fā)病機制。

人體成熟T淋巴細胞亞群按功能不同可分為:輔助性T淋巴細胞(Th)、抑制性T淋巴細胞(Ts)和細胞毒性T淋巴細胞(Tc)；若按表型又可以分為CD 4+T淋巴細胞和CD 8+T淋巴細胞。CD 4+T淋巴細胞主要行使Th細胞的功能，而CD 8+T淋巴細胞主要行使Tc細胞的功能，因此根據(jù)CD 4+T淋巴細胞和CD 8+T淋巴細胞的數(shù)量，可初步評估機體免疫狀態(tài)。研究表明，惡性血液病患者機體免疫功能失衡導(dǎo)致機體免疫力下降，抗腫瘤能力減弱，T淋巴細胞亞群的檢測可以為惡性血液病的診斷、治療及判斷預(yù)后提供依據(jù)[8]。另有研究顯示[9]細胞免疫與白血病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有關(guān)。本研究結(jié)果回示：ALL患兒初診組及緩解組外周血CD 3+T淋巴細胞、CD 4+T淋巴細胞的表達水平均低于對照組(P<0.05)，而CD 8+T淋巴細胞的表達水平高于對照組(P<0.05)，初診組與緩解組之間的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示ALL患兒存在不同程度的免疫異常，與文獻報告一致。

細胞因子介導(dǎo)的細胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主要方式。大量研究表明細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡是腫瘤細胞能夠免疫逃逸的機制之一，與兒童白血病相關(guān)的細胞因子有干擾素調(diào)節(jié)因子-3(IRF-3)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)、干擾素(IFN)和Toll樣受體(TLR)等[6]。IL-17是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子，主要由Th 17細胞產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細胞因子、趨化因子、炎癥效應(yīng)物質(zhì)和抗微生物蛋白，從而參與多種自身免疫性疾病和感染炎癥[10]。近年來，發(fā)現(xiàn)IL-17與腫瘤的關(guān)系密切。一方面IL-17可以通過誘導(dǎo)腫瘤的血管生成等來發(fā)揮促瘤效應(yīng)；另一方面它又可以通過增強NK細胞、細胞毒性T細胞的活性來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[11]。Th 17的表達根據(jù)不同的腫瘤類型而有差異。如在肺腫瘤中發(fā)現(xiàn)IL-17有效促進非小細胞肺癌細胞的生長和增殖，對肺癌調(diào)節(jié)性T細胞的免疫反應(yīng)具有抑制作用[12]。在白血病患兒中的研究中發(fā)現(xiàn)[13]Th 17的表達低于對照組，且未緩解組更低。分析其原因可能為：(1)白血病細胞可能分泌一些抑制Th 17功能的因子，未緩解時體內(nèi)腫瘤負荷高，抑制作用更強。(2)白血病患者由于經(jīng)過化療或放療，機體免疫系統(tǒng)遭到破壞，因此，初始T細胞數(shù)量減少，其所分化的Th 17當(dāng)然更少。(3)機體還存在一些抑制Th 17細胞的細胞亞群，如Th 1和調(diào)節(jié)性T細胞等，當(dāng)白血病經(jīng)過化療達到緩解時，雖然Th 17的功能有所恢復(fù)，但這些抑制Th 17的細胞功能也有所恢復(fù)，綜合作用的結(jié)果就是抵消了Th 17數(shù)量和功能的提高[14]。本研究結(jié)果回示：ALL患兒初診組及緩解組外周血IL-17的水平均低于對照組(P<0.05)，提示IL-17可能參與了ALL患兒的發(fā)生發(fā)展。

IL-35屬于IL-12家族，是一種由p 35和EBI 3亞基組成的異源二聚體分子,主要來源于Tregs并為其發(fā)揮最大免疫抑制功能所必需，從而在誘導(dǎo)和維持機體免疫耐受過程中發(fā)揮了重要作用[15-16]。目前研究認為IL-35可能廣泛參與了體內(nèi)的免疫應(yīng)答過程，不僅在細胞內(nèi)感染及炎癥過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而且與自身免疫病和腫瘤等多種臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，成為細胞因子研究的新熱點[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18]，IL-35在AML患者體內(nèi)高表達，分析原因可能為：IL-35通過抑制效應(yīng)性T細胞(effector T cells,Teffs)和促進Tregs/iTr 35(IL-35誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細胞)的表達和功能以及直接促進AML細胞的增殖和抑制AML細胞的凋亡來誘導(dǎo)AML細胞的免疫逃逸，從而在介導(dǎo)AML的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。但在ALL中的發(fā)病機制目前不完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)：ALL患兒初診組及緩解組外周血IL-35的水平均高于對照組(P<0.05)，提示IL-35可能也參與了ALL患兒的發(fā)病過程。

綜上所述，本研究表明，ALL患兒存在不同程度的免疫異常，外周血中IL-17的表達水平降低、IL-35的表達水平升高，且CD 4+T淋巴細胞的表達水平與IL-17的水平呈正相關(guān)，與IL-35的水平呈負相關(guān)，提示免疫異常、IL-17的低表達及IL-35的高表達可能參與了ALL的發(fā)生發(fā)展，但兩兩之間是否具有一定的因果關(guān)系，需要更加深入的研究。

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Objective The study was to detect the levels of IL-17 and IL-35 and the expression of T lymphocyte subsets in peripheral blood, to explore its role in the pathogenesis of acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods One hundred and forty-one cases with ALL were divided into two groups: Group A (n=76) who were confirmedly diagnosed but not yet treated; Group B (n=65) who were confirmedly diagnosed and treated systematically with chemotherapy; and 45 healthy children were selected as the control group. Flow cytometry (FCM) was used to measure the expression of T lymphocyte subsets, and the levels of IL-17 and IL-35 were determined with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Results The level of IL-17 in Group A and Group B was significantly lower than that in control group (P<0.05). On the contrary, the level of IL-35 in Group A and Group B was significantly higher than that in control group (P<0.05). The expressions of CD 3+T and CD 4+T cells in Group A and Group B were significantly lower than those in control group (P<0.05),and the CD 8+T cells level increased significantly (P<0.05), significant difference was found between Group A and Group B (P<0.05). The expression of CD 4+T cells was positively correlated with the level of IL-17 (r=0.678,P<0.01), but negatively correlated with the level of IL-35 (r=-0.688,P<0.01). Conclusion There are immune disorders of varying degrees in ALL children, and the expression of IL-17 and IL-35 in peripheral blood may paly an important role in the pathogenesis of ALL.

Acute lymphocytic leukemia; Interleukin-17; Interleukin-35; T lymphocyte subsets; Child

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.2.003

河南 450052 鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院小兒血液/腫瘤科 （王西閣 張曉敏 趙雪蓮 周玉潔 任瑞芳）