miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達及其對腫瘤血管生成的作用*

王秀　杜冀暉　黃虞　龔慧　王磊　李一凡

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miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達及其對腫瘤血管生成的作用*

王秀杜冀暉黃虞龔慧王磊李一凡

摘要目的：探討miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達及其對腫瘤血管新生功能的影響和作用機制。方法：采用qRT-PCR方法檢測廣東醫(yī)學院附屬深圳南山醫(yī)院2014年6月至2015年12月經(jīng)手術(shù)切除的25例結(jié)直腸癌組織和對應癌旁組織及4種結(jié)直腸癌細胞（HCT116、SW620、SW480、HT29）中miR-92a的表達；免疫組織化學法檢測結(jié)直腸癌和癌旁組織中CD31陽性表達的微血管密度（microvessel density，MVD），Pearson相關(guān)性分析探討miR-92a表達與腫瘤血管新生MVD的相關(guān)性。通過轉(zhuǎn)染miR-92a-mimic、inhibitor上調(diào)或抑制結(jié)直腸癌細胞HCT116、SW620中miR-92a的表達水平，采用小管形成實驗檢測miR-92a不同表達對HUVEC小管形成的影響，免疫印跡法檢測對其下游潛在靶點PTEN的蛋白表達的影響。結(jié)果：結(jié)直腸癌組織miR-92a的表達水平顯著高于對應癌旁組織（P＜0.01）；4種人結(jié)腸癌細胞系miR-92a的表達水平均顯著高于正常腸上皮組織（P＜0.05）；結(jié)直腸癌組織CD31陽性微血管密度顯著高于癌旁組織（P＜0.01），miR-92a表達水平與結(jié)直腸癌血管新生MVD呈顯著正相關(guān)（r=0.580，P=0.01）；上調(diào)miR-92a表達的HCT116細胞培養(yǎng)上清液可以顯著促進HUVEC小管形成（P＜0.05）；上調(diào)miR-92a表達可以顯著抑制HCT116細胞中PTEN蛋白表達水平（P＜0.01）。結(jié)論：miR-92a在結(jié)直腸癌細胞和組織中高表達，與腫瘤血管新生增加密切相關(guān)；miR-92a可能通過抑制PTEN的表達發(fā)揮促進結(jié)直腸癌血管新生的生物學功能。

關(guān)鍵詞miR-92a結(jié)直腸癌血管新生PTEN

作者單位：廣東醫(yī)學院附屬深圳南山醫(yī)院中心實驗室（廣東省深圳市518052）

*本文課題受深圳市科技計劃項目（編號：JCYJ20140411092959841）和深圳市南山區(qū)技術(shù)研發(fā)和創(chuàng)意設(shè)計項目分項資金教育（衛(wèi)生）科技項目（編號：南科研衛(wèi)2013002）資助

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是人類常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位，起病隱匿，預后較差［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs （miRNAs）是一類獨特的非編碼小RNA，在腫瘤細胞中高表達或低表達起到癌基因或抑癌基因的作用，使細胞增殖和分化失去控制，導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］。研究證實，miR-92a在結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中異常高表達［3］，并與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后相關(guān)［4］，因此，miR-92a被認為是一種癌基因，可能在CRC發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵調(diào)控作用［5］。具有非可控的血管新生能力是惡性腫瘤的基本生物學特征之一，腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移均與血管新生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a與血管內(nèi)皮細胞形成、腫瘤血管新生有關(guān)［6-7］。然而，目前有關(guān)miR-92a對結(jié)直腸癌血管新生功能的影響及其調(diào)控機制尚不清楚。本研究檢測miR-92a在結(jié)直腸癌組織中的表達水平，分析其與腫瘤血管新生的相關(guān)性；通過轉(zhuǎn)染miR-92amimic、inhibitor上調(diào)或抑制結(jié)直腸癌細胞HCT116、SW620中miR-92a的表達水平，觀察miR-92a對HUVEC血管內(nèi)皮細胞新生功能的影響及對其下游潛在靶點PTEN表達的調(diào)控作用，探討miR-92a影響結(jié)直腸癌血管新生的作用及機制，為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本收集廣東醫(yī)學院附屬深圳南山醫(yī)院2014年6月至2015年12月經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)直腸癌及對應癌旁組織（距腫瘤邊緣＞4 cm）標本25例。其中男性12例，女性13例；年齡32～84歲，平均年齡（59.2±13.1）歲。入選患者均知情同意并且經(jīng)過本院倫理審查委員會審查批準，術(shù)前未經(jīng)放化療治療，切除標本分別于液氮或中性甲醛中保存。

1.1.2細胞株人結(jié)直腸癌細胞HCT116、SW620、HT29、SW480由香港中文大學贈與，人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC由中山大學贈與。

1.1.3主要試劑TRIzol Reagent、Lipofectamine?2000、RNA逆轉(zhuǎn)錄及擴增試劑盒均購自美國Life Technologies公司；逆轉(zhuǎn)錄引物、miR-92a上游引物和下游引物、miR-92a-3p mimic和miR-92a-3p inhibitor及相應陰性對照均由廣州市銳博生物科技有限公司合成；高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，人臍靜脈內(nèi)皮細胞Human Endothelial SFM培養(yǎng)基及添加因子購自美國Life Technologies公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；兔抗人PTEN單克隆抗體（ab154814，克隆號：EPR7495）購自英國Abcam公司；羊抗兔二抗（111-035-003）購自美國Jackson公司；兔抗人GAPDH單抗（10494-1-AP）購自美國Proteintech公司；鼠抗人CD31單抗（ZM-0044，克隆號：1A10）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ABC免疫組織化學試劑盒（PK-6102）購自美國Vector公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)結(jié)直腸癌細胞HCT116、SW620、HT29和SW480培養(yǎng)于高糖DMEM完全培養(yǎng)基，人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC采用Endothelial SFM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加生長因子構(gòu)成的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5% CO2培養(yǎng)、穩(wěn)定傳代2～3代，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2qRT-PCR方法檢測miR-92a表達按TRIzol試劑說明書提取結(jié)直腸癌組織和細胞中總RNA，按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書設(shè)置反轉(zhuǎn)錄條件。每個樣本取1 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應條件為42℃60 min，70℃10 min。取1 μL cDNA進行PCR擴增，反應條件為50℃2 min，95℃10 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，40個循環(huán)。組織中miR-92a表達采用絕對定量方法，根據(jù)標準品建立標準曲線和回歸方程，計算miR-92a的濃度。miRNAs定量進行標準化，結(jié)果以總RNA/μg中的miRNAs含量表示（fmol/μg總RNA）。細胞中提取的RNA以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct的方法計算各組miR-92a的相對表達量，實驗重復3次，計算平均值。

1.2.3免疫組織化學法檢測結(jié)直腸癌組織血管新生情況組織標本常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作4 μm切片。采用檸檬酸鹽緩沖液進行高壓熱修復，一抗為鼠抗人CD31單抗（1:100），以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性片作為陽性對照，按照ABC法檢測內(nèi)皮細胞CD31表達。血管新生情況以微血管密度（microvessel density，MVD）表示，以CD31陽性表達的棕黃色血管內(nèi)皮細胞或細胞簇代表1條單獨的微血管，先在低倍鏡（×100）下選擇血管高密度區(qū)，再于高倍鏡（×400）下隨機選取5個視野，計算其微血管數(shù)目平均值。

1.2.4細胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期人結(jié)直腸癌細胞HCT116和SW620細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染。細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)細胞至融合度達60%左右。實驗組分別加入50 nM miR-92a mimic和100 nM的miR-92a inhibitor及5 μL轉(zhuǎn)染試劑；對照組分別加入相應陰性對照（negative control，NC）。1×Opti-MEM培養(yǎng)基調(diào)整終體積至2 mL培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細胞用于提取RNA，轉(zhuǎn)染72 h后收集細胞蛋白和無血清培養(yǎng)上清液（條件培養(yǎng)基）用于后續(xù)實驗。

1.2.5小管形成實驗96孔板每孔鋪50 μL Matrigel基質(zhì)膠、接種1×104個HUVEC，培養(yǎng)24 h，實驗組、對照組分別加入對應已收集的轉(zhuǎn)染miR-92a mimic、inhibitor的HCT116和SW620細胞條件培養(yǎng)基100 μL，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，6 h后于顯微鏡下觀察，HUVEC生長形成閉合環(huán)狀小管樣結(jié)構(gòu)的作為1個新生小管進行計數(shù)。每組設(shè)3個復孔，每孔取3個視野計算平均值。

1.2.6免疫印跡法檢測PTEN表達制備10%SDSPAGE凝膠，每孔加入30 μg蛋白樣品，經(jīng)SDS電泳1 h分離蛋白，濕法電轉(zhuǎn)PVDF膜3 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入兔抗人PTEN一抗（1:2 000），于4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，10 min/次。加入羊抗兔二抗（1:4 000），常溫孵育1 h，TBST漂洗6次，5 min/次。滴加ECL顯影液，采用化學發(fā)光成像儀成像，測定目的條帶灰度值、分析蛋白表達，以GAPDH為內(nèi)參計算PTEN蛋白相對表達量。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料結(jié)果用x±s表示，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗法進行數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗，對于符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)，兩組間均值差異比較采用t檢驗，結(jié)直腸癌組織miR-92a表達與血管新生MVD的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1miR-92a在結(jié)直腸癌組織及細胞中的表達

結(jié)直腸癌患者的癌組織（T）及與其相對應的癌旁組織（TAT）miR-92a的表達水平（圖1A）所示。25例CRC組織的miR-92a表達水平為（1.102±0.735）（fmol/μg總RNA），顯著高于癌旁組織的（0.037±0.031）（fmol/μg總RNA），差異具有統(tǒng)計學意義（t=7.405，P＜0.01）。以正常結(jié)直腸上皮黏膜組織（normal tissue，NT）為對照，4種CRC細胞系中miR-92a的表達水平均顯著高于正常對照，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中HCT116細胞miR-92a表達最低，SW620細胞miR-92a表達最高（圖1B）。

2.2miR-92a表達與結(jié)直腸癌血管新生MVD的相關(guān)性

免疫組織化學法染色檢測25例結(jié)直腸癌組織和對應癌旁組織血管新生情況（圖2）。結(jié)果顯示，CRC癌組織CD31陽性表達的MVD為（27.400±7.560），顯著高于對應癌旁組織MVD數(shù)量（10.760±3.140），差異具有統(tǒng)計學意義（t=9.829，P＜0.01）。Pearson相關(guān)性分析顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-92a的表達與CD31陽性的微血管密度呈顯著正相關(guān)（r=0.580，P=0.01）。

圖1　miR-92a在結(jié)腸癌組織及細胞中的表達水平Figure 1　Expression of miR-92a in CRC tissue and cell

圖2　結(jié)直腸癌組織miR-92a表達與腫瘤血管新生的相關(guān)性Figure 2 Correlation between miR-92a expression and tumor angiogenesis in CRC

2.3miR-92a高表達和抑制表達的細胞模型建立

分別選擇miR-92a表達相對最低、最高的HCT116、SW620細胞，通過瞬時轉(zhuǎn)染miR-92a-mimic、inhibitor上調(diào)或抑制其miR-92a的表達水平，結(jié)果所示（圖3）與陰性對照組比較，HCT116細胞轉(zhuǎn)染miR-92a mimic 48 h后，其miR-92a的水平顯著升高（t=7.439，P＜0.05），SW620細胞轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor 48 h后，其miR-92a的水平顯著降低（t=-45.916，P＜0.01）。

2.4結(jié)直腸癌細胞miR-92a高表達或抑制表達對HUVEC小管形成能力的影響

小管形成實驗結(jié)果顯示，應用轉(zhuǎn)染miR-92a mimic上調(diào)HCT116細胞miR-92a表達的條件培養(yǎng)基作用6 h，HUVEC形成完整閉合小管的數(shù)量明顯高于對照組（t=5.563，P＜0.05）；相反，應用轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor抑制SW620細胞miR-92a表達的條件培養(yǎng)基作用6 h，HUVEC形成閉合小管的數(shù)量明顯低于對照組（t=-6.107，P＜0.05，圖4）。

2.5miR-92a高表達或抑制表達對結(jié)直腸癌細胞PTEN蛋白表達的影響

經(jīng)Targetscan軟件對miR-92a的靶向基因進行預測，結(jié)果顯示miR-92a的種子序列與PTEN基因3'UTR之間存在靶向結(jié)合位點（圖5A），提示PTEN可能是miR-92a的調(diào)控靶基因。轉(zhuǎn)染miR-92a mimic使HCT116細胞miR-92a顯著升高，其PTEN蛋白條帶灰度值下降26.40% （t=-15.176，P＜0.01）；轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor使SW620細胞中miR-92a表達水平顯著降低，其PTEN蛋白條帶灰度值升高21.98%（t=10.911，P＜0.01，圖5B，5C，5D）。結(jié)果提示miR-92a的表達水平與PTEN蛋白表達呈負相關(guān)。

圖3　轉(zhuǎn)染miR-92a mimic、inhibitor上調(diào)或抑制結(jié)直腸癌細胞miR-92a表達水平Figure 3 Expression of miRNA-92a in HCT116 and SW620 cells transfected with miR-92a mimic or inhibitor

圖4　結(jié)直腸癌細胞miR-92a高表達或抑制表達對HUVEC小管形成能力的影響Figure 4　Effect of miR-92a overexpression or suppression in CRC cells on the formation of HUVEC tubules

圖5　miR-92a高表達或抑制表達對結(jié)直腸癌細胞PTEN蛋白表達的影響Figure 5　Effect of miR-92a overexpression or suppression on the PTEN protein expression in CRC cells

3　討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中存在多種miRNA的異常表達，其靶基因參與調(diào)控結(jié)直腸細胞的惡性轉(zhuǎn)化、增殖、轉(zhuǎn)移等進程［8］。miR-92a是miR-17-92基因簇家族的一員，Ng等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR-17-3p、miR-92在結(jié)直腸癌組織和患者血漿中升高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-92a在結(jié)直腸癌患者血清中異常高表達，有望作為新型的CRC診斷標志物［10］。本研究進一步證實結(jié)直腸癌組織中miR-92a的表達水平顯著高于對應癌旁組織；4種人結(jié)腸癌細胞中miR-92a的表達水平均顯著高于正常腸上皮對照，與其他報道一致［3-4，9］，提示miR-92a在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮促癌基因的作用。

研究表明，miRNA能通過靶向作用于血管生成因子和蛋白激酶，調(diào)控血管生成的信號，從而促進或抑制腫瘤的血管生成［11］。Dews等［7］研究發(fā)現(xiàn)在k-RAS轉(zhuǎn)化的腸道細胞中過表達miR-17-92基因簇，能夠促進腫瘤血管的生長。本研究顯示，miR-92a高表達的癌組織CD31陽性MVD顯著高于miR-92a低表達的癌旁組織，miR-92a表達水平與結(jié)直腸癌微血管密度呈顯著正相關(guān)。通過在結(jié)直腸癌細胞HCT116和SW620中分別轉(zhuǎn)染miR-92a mimic及inhibitor上調(diào)和下調(diào)miR-92a的表達，結(jié)果表明高表達miR-92a的細胞培養(yǎng)上清液能顯著促進HUVEC的小管形成，而miR-92a低表達的細胞培養(yǎng)上清液作用于HUVEC的小管形成明顯減少，提示結(jié)直腸癌miR-92a高表達具有促進血管新生的生物學功能。有研究報道，結(jié)直腸癌細胞能通過分泌包含miR-92a的微泡（microvesicles，MVs）作用于血管內(nèi)皮細胞，下調(diào)靶基因Dkk-3表達促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移，建立適合腫瘤血管生成的微環(huán)境，促進腫瘤生長［12］。

本研究進一步通過生物信息分析預測發(fā)現(xiàn)PTEN可能是miR-92a的下游調(diào)控靶基因。已知PTEN是PI3K/ AKT信號通路上重要的抑制分子，可以通過介導VEGF的表達參與血管新生的調(diào)節(jié)過程［13］，PTEN的缺失或者表達下調(diào)能促進腫瘤的血管生成［14］。Zhang等［15］研究顯示miR-92a通過抑制PTEN的表達，誘導結(jié)直腸癌細胞EMT轉(zhuǎn)化，促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)直腸癌細胞miR-92a的表達水平與PTEN蛋白表達呈負相關(guān)，提示miR-92a可能通過抑制PTEN的表達發(fā)揮調(diào)控作用，促進結(jié)直腸癌的血管新生。

綜上所述，miR-92a在結(jié)直腸癌組織中高表達，與癌組織血管新生增加密切相關(guān)。miR-92a可能通過抑制PTEN的表達發(fā)揮促進結(jié)直腸癌血管新生的生物學功能。因此，miR-92a可能成為結(jié)直腸癌新的分子標志物及治療靶點。由于一個miRNA可以調(diào)控多個基因的表達，有關(guān)miR-92a靶向調(diào)控腫瘤血管新生的分子機制及其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍有待進一步深入探究。

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（2016-01-11收稿）（2016-03-02修回）

（編輯：邢穎校對：張抿）

王秀專業(yè)方向為miR-92a與結(jié)直腸癌血管新生研究。

E-mail：xiuxiuwang66@163.com

·臨床研究與應用·

Expression of miR-92a in colorectal cancer and its effect on tumor angiogenesis

Xiu WANG，Jihui DU，Yu HUANG，Hui GONG，Lei WANG，Yifan LI

Correspondence to: Jihui DU；E-mail: jihuidu@163.com

Central Laboratory，Affiliated Nan Shan Hospital，Guangdong Medical College，Shenzhen 518052，China

This work was supported by the Shenzhen Science and Technology Project（No.JCYJ20140411092959841）and the Fund for Education and Public Hygiene of the Technological Invention and Creative Design Project of the Shenzhen Nanshan District（No.2013002）

AbstractObjective: To investigate the expression of miR-92a in colorectal cancer（CRC）and its effect on the regulation mechanisms of tumor angiogenesis.Methods: The miRNA-92a expression in 25 CRC tissues and HT29，SW620，SW480，and HCT116 CRC cells was detected using quantitative real-time polymerase chain reaction.The CD31 positive expression of blood microvessels in CRC tissues was measured by immunohistochemistry.Pearson correlation analysis was used to analyze the relationship between miR-92a and tumor angiogenesis.The miR-92a mimic or inhibitor was transfected into HCT116 and SW620 cells in vitro to upregulate or downregulate the miR-92a expression.The effect of miR-92a overexpression or suppression on the formation of human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）tubules was detected by tube formation assay.Changes in phosphatase and tensin homolog（PTEN）protein expression were measured by Western blot.Results: The expression level of miR-92a in CRC tissues was significantly higher than that in matched adjacent tissues（P＜0.01）.The expression levels of miR-92a in HT29，SW480，SW620，and HCT116 colon cancer cell lines were significantly higher than that of the normal colorectal epithelium control（P＜0.05）.The number of CD31 positive expression of microvessel density（MVD）in CRC tissues was significantly higher than that in adjacent tissues（P＜0.01），and the miR-92a expression level was positively correlated with the MVD in CRC tissues（r=0.580，P=0.01）.The cell culture supernatant of HCT116 with miR-92a overexpression could significantly promote the formation of HUVEC tubules（P＜0.05）.The upregulation of miR-92a expression could significantly inhibit the expression of PTEN protein in CRC cells（P＜0.01）.Conclusion: The miR-92a was highly expressed in CRC cells and tissues，which was closely related to the formation of tumor angiogenesis in CRC.The miR-92a could promote tumor angiogenesis in CRC by inhibiting PTEN expression.

Keywords:miR-92a，colorectal cancer，angiogenesis，PTEN

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.06.012

通信作者：杜冀暉jihuidu@163.com

作者簡介