白黃鏈霉菌TD-1菌株揮發(fā)性有機物對灰霉孢菌的抑制作用

李貞景，張春慧，路來風，武淑芬，陳勉華，韓昕男，王昌祿

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院/食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津300457）

白黃鏈霉菌TD-1菌株揮發(fā)性有機物對灰霉孢菌的抑制作用

李貞景，張春慧，路來風，武淑芬，陳勉華，韓昕男，王昌祿*

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院/食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津300457）

為探討白黃鏈霉菌TD-1菌株揮發(fā)性有機物（VOCs）對灰霉孢菌的抑制作用，采用雙皿對扣法測定VOCs對灰霉孢菌的抑菌率，通過掃描電鏡觀察VOCs對灰霉孢菌菌絲體的影響，利用GC/ MS技術(shù)對VOCs組分進行分析。結(jié)果表明，作用5 d后，6.0 g TD-1菌株麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌的抑菌率為66.67%，灰霉孢菌的產(chǎn)孢量（3.9×106個/ cm2）較空白組（5.9×107個/ cm2）顯著降低（p＜0.01），且菌絲形態(tài)異常、表面粗糙，菌體細胞膜通透性增強。TD-1菌株VOCs由63種組分組成，其中2-甲基異冰片（13.52%）和1，4-二甲基金剛烷（14.08%）的相對含量較高。白黃鏈霉菌TD-1菌株產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌良好的抑制作用為將其開發(fā)成生物熏蒸劑提供了理論依據(jù)。

白黃鏈霉菌；灰霉孢菌；揮發(fā)性有機物；抑菌活性

灰霉孢菌（Botrytis cinerea）是引起瓜果蔬菜及大部分果樹真菌性病害的主要病原菌之一。其中，由灰霉孢菌引起的灰霉病是導致番茄和葡萄產(chǎn)量和質(zhì)量下降的最主要病害。統(tǒng)計顯示，每年約有20%的番茄產(chǎn)量損失是由灰霉病引起的［1］。因此，加強灰霉病的防治對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和果蔬保鮮具有重要意義。目前，已有植物源和微生物源天然抑菌劑應用于果蔬灰霉病的防治［2］，但利用生防菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物（volatile organic compounds，VOCs）抑制灰霉孢菌的報道較少。

鏈霉菌是植物病害主要的生防菌之一，廣泛存在于自然界，其代謝產(chǎn)物可分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質(zhì)，其中揮發(fā)性物質(zhì)因安全性高、抑菌作用強和殘留低等優(yōu)勢越來越受到國內(nèi)外學者的關(guān)注［3］。據(jù)報道，Streptomyces globisporus JK-1菌株揮發(fā)性物質(zhì)對四季桔青霉病等具有良好的防治作用［4］，常溫下中等濃度VOCs熏蒸處理（120 g/ L）可以有效降低70.3%的采后砂糖橘果實自然發(fā)病率。

目前，對白黃鏈霉菌（Steptomyces alboflavus）抑菌活性及抑菌物質(zhì)的研究較少。JI Zhiqin等［5］從白黃鏈霉菌313中分離純化出兩種新型的環(huán)己肽類化合物NW-G08和NW-G09，這兩種物質(zhì)對抗藥性金黃色葡萄球菌的抑制效果高于氨芐青霉素。單莉萍等［6］的研究結(jié)果表明，白黃鏈霉菌能產(chǎn)生抑制灰霉病的活性物質(zhì)，且能通過提高番茄片中抗病相關(guān)酶的活性來抵御灰霉病菌的感染。本課題組從飼料廠附近土樣中篩選得到一株對串珠鐮刀菌具有良好拮抗作用的白黃鏈霉菌TD-1菌株［7］，研究發(fā)現(xiàn)，該菌株在麥粒培養(yǎng)物上產(chǎn)生的VOCs對串珠鐮刀菌菌落生長直徑的抑制作用與該菌株麥粒培養(yǎng)物的質(zhì)量呈正效應關(guān)系，隨著培養(yǎng)皿內(nèi)麥粒培養(yǎng)物質(zhì)量的增加，其菌落直徑逐漸減小，在16 g/皿時，串珠鐮刀菌的菌餅5 d未見生長［8 -9］?；谇捌谘芯炕A，本研究繼續(xù)對白黃鏈霉菌TD-1菌株產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌的抑菌活性及抗菌物質(zhì)進行研究，為將其研發(fā)成高效、安全、環(huán)保的微生物熏蒸劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

白黃鏈霉菌TD-1（S.alboflavus TD-1），本實驗室自天津市寶坻區(qū)飼料廠儲糧倉附近土樣中篩選并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（編號:CGMCC No.4666）。Botrytis cinerea，由天津市畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

鏈霉菌TD -1活化培養(yǎng)基:高氏一號固體培養(yǎng)基。

鏈霉菌TD-1種子培養(yǎng)基:葡萄糖65.0 g，黃豆粉10.0 g，KNO30.5 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.5 g，KCl 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，自來水1 000.0 mL，pH值7.2。

灰霉孢菌培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

1.3 鏈霉菌TD-1種子液及麥麩培養(yǎng)物的制備

將TD-1菌株劃線接種于高氏一號固體培養(yǎng)基上進行活化，30℃培養(yǎng)5～6 d后制備成106～108CFU/ mL孢子懸液，按1%體積比接種于鏈霉菌種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/ min搖床培養(yǎng)2 d，得鏈霉菌TD-1種子液。

取20 g麥麩置于250 mL錐形瓶內(nèi)，按質(zhì)量比1∶1加入自來水，121℃、20 min滅菌。接種4.0 mL鏈霉菌種子液于麥麩上，30℃下培養(yǎng)8 d。

1.4 灰霉孢菌菌餅的制備

取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的灰霉孢菌，無菌水洗下孢子，8層紗布過濾，制成孢子濃度為106～108CFU/ mL的孢子懸液。取1 mL加入到10 mL約40℃的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基冷卻后，用打孔器打孔，得到直徑6 mm的灰霉孢菌菌餅。

1.5 鏈霉菌TD-1 VOCs抑菌活性的測定

采用雙皿對扣法測定TD-1菌株VOCs的抑菌活性［10］。取2個直徑為90 mm的培養(yǎng)皿的皿底，一個倒入15 mL PDA培養(yǎng)基，冷卻后將灰霉孢菌菌餅置于培養(yǎng)基中央，另一個放置6.0 g TD-1菌株麥麩培養(yǎng)物。將有灰霉孢菌菌餅的皿底對扣于含麥麩培養(yǎng)物的皿底上，封口膜封口，以含有相同質(zhì)量的無菌麥麩培養(yǎng)皿為空白對照，30℃培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法測定處理組及空白組灰霉孢菌菌落直徑，并用式（1）計算TD-1菌株VOCs的抑菌率。

1.6 VOCs對灰霉孢菌產(chǎn)孢能力及菌絲形態(tài)的影響實驗

1.5中雙皿對扣法培養(yǎng)結(jié)束后，采用血球板計數(shù)各組中灰霉孢菌的孢子數(shù)，并在掃描電鏡下觀察灰霉孢菌的菌絲形態(tài)。

1.7 VOCs對灰霉孢菌細胞膜通透性的影響實驗

按1.5中的雙皿對扣法，下層皿底為TD-1麥麩培養(yǎng)物，上層皿底倒入PDA培養(yǎng)基，冷卻后平鋪無菌玻璃紙（1.5 cm×1.5 cm）。將0.5 mL孢子懸液均勻涂布于玻璃紙上，以等質(zhì)量的無菌麥麩為空白對照，封口膜密封，30℃培養(yǎng)一定時間后，5 mL無菌水洗下菌體，離心，分光光度計測定上清液OD260值［11］。

1.8 VOCs的GC/ MS分析鑒定

鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物培養(yǎng)8 d后，其VOCs用頂空固相萃取法收集后利用GC/ MS分析檢測［8］，檢測條件如下。

氣相色譜條件:VF-5MS型色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度250℃。載氣He純度99.999%，分流比10∶1，流速1 mL/ min，程序升溫，初始溫度40℃（保持3 min），以4℃/ min升至150℃（保持1 min），以8℃/ min升至250℃（保持6 min），根據(jù)氣相色譜峰面積歸一法確定各組分含量。

質(zhì)譜條件:EI離子源，電離能量70 eV，離子阱溫度220℃，傳輸線溫度280℃，溶劑延遲時間1.5 min。全掃描方式，掃描范圍43～500 m/ z，檢索譜庫NIST05。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS統(tǒng)計分析軟件（Version 13.0，SPSS Inc.，Chicago，USA）對各項數(shù)據(jù)進行分析。用最小顯著差數(shù)法比較不同處理的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 VOCs的GC/ MS分析鑒定

發(fā)酵8 d的鏈霉菌TD -1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs總離子流色譜如圖1。通過NIST05數(shù)據(jù)庫比對質(zhì)譜圖和相對保留時間共鑒定出63種揮發(fā)性組分，結(jié)果如表1。由表1可以看出，在不同培養(yǎng)時間內(nèi)鏈霉菌TD-1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)種類幾乎相同，但相對含量變化較大，經(jīng)GC/ MS分析共鑒定出63種化合物，其中烯烴類、烷烴類和芳香烴類化合物較多。結(jié)合圖1和表1的結(jié)果，鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs中二甲基異冰片和1，4-二甲基金剛烷相對含量較高，其相對含量分別為13.52%和14.08%。

圖1 S.alboflavus TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生VOCs總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of VOCs from S.alboflavus TD-1 grown on autoclaved wheat bran

表1 鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物揮發(fā)性成分及相對含量Tab.1 Volatile components and relative contents of S.alboflavus TD-1 bran culture

續(xù)表1

2.2 VOCs對灰霉孢菌的抑制作用分析

6.0 g鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌的抑制作用結(jié)果如圖2?？瞻讓φ战M中灰霉孢菌菌落直徑為7.20 cm，而受6.0 g鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs作用5 d的灰霉孢菌菌落直徑為2.40 cm，對灰霉孢菌的抑菌率達到66.67%。由此可見，鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌的生長具有良好的抑制作用。

圖2 鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌抑制作用Fig.2 Effects of VOCs from S.alboflavus TD-1 grown on autoclaved wheat bran on mycelial growth of B.cinerea

2.3 VOCs對灰霉孢菌產(chǎn)孢能力的影響

6.0 g鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌孢子數(shù)量的影響如圖3。VOCs作用5 d后，實驗組中灰霉孢菌孢子數(shù)量（3.90×106個/ cm2）明顯低于空白對照組（5.90×107個/ cm2）（p＜0.01），抑制率為93.39%，表明鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs能明顯抑制灰霉孢菌孢子的產(chǎn)生。

圖3 鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌產(chǎn)孢能力的影響Fig.3 Effects of VOCs from S.alboflavus TD-1 grown on autoclaved wheat bran on sporulation of B.cinerea

2.4 VOCs對灰霉孢菌細胞膜通透性的影響

細胞膜是維持細胞完整性及保持正常物質(zhì)和能量代謝的基礎，當細胞膜遭到破壞時，細胞膜通透性增大，胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)、磷酸鹽、碳酸鹽、DNA和RNA等能通過細胞膜釋放出來，而這些核內(nèi)物質(zhì)在260 nm處有很強的紫外吸收，因此，細胞懸液的OD260值能反應細胞膜的通透性［12 -13］。6.0 g鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌核酸泄露的影響如圖4。由圖4可知，鏈霉菌TD -1 VOCs作用于灰霉孢菌后，其細胞懸液的OD260值高于空白對照組，表明鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌的細胞膜具有一定的破壞作用。

圖4 鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌細胞膜通透性的影響Fig.4 Effects of VOCs from S.alboflavus TD-1 grown on autoclaved wheat bran on mycelial membrane permeability of B.cinerea

2.5 VOCs對灰霉孢菌菌絲形態(tài)的影響

6.0 g鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌菌絲形態(tài)影響的掃描電鏡圖如圖5。圖5結(jié)果表明，空白組菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，菌絲體圓潤飽滿，表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)，能夠產(chǎn)生大量孢子。而受VOCs抑制的菌絲生長畸形，表面凹凸不平，粗細不均，菌絲甚至會出現(xiàn)破損現(xiàn)象，只能產(chǎn)生少量的孢子。

圖5 鏈霉菌TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌菌絲形態(tài)影響的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electronic micrographs of hypha of B.cinerea germinated in absence or presence of VOCs from S.alboflavus TD-1 grown on autoclaved wheat bran

3 討 論

利用微生物代謝的VOCs在密閉條件下防治植物病害是一種新的防治措施，與動、植物源熏蒸劑相比，其具有繁殖快，生長周期短，易改良，適應性強，不受季節(jié)限制，易培養(yǎng)等優(yōu)點。

本實驗以灰霉孢菌為指示菌，在離體條件下對S.alboflavus TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生VOCs進行抑菌活性實驗。研究結(jié)果表明，6.0 g的S.alboflavus TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs能明顯抑制灰霉孢菌的生長，抑制率為66.67%。此外，VOCs還能抑制灰霉孢菌的產(chǎn)孢能力，并使細胞膜通透性增大、細胞形態(tài)異常、菌絲表面粗糙、分節(jié)增多，這與陳華等［14］、LI等［4］的研究結(jié)果相似。本課題組另外的研究結(jié)果還表明，S.alboflavus TD-1的發(fā)酵液對灰霉孢菌同樣具有抑制作用，其中發(fā)酵原液體外對灰霉病菌菌生長的抑制率為98.10%，對番茄植株上灰霉病的抑制率為76.98%，且能通過提高番茄葉片中抗病相關(guān)酶的活性來抵御灰霉病的感染［6］。S.alboflavus TD-1產(chǎn)生的VOCs對實體植株灰霉病的防治效果及活性酶的影響有待進一步研究。

微生物代謝產(chǎn)生的VOCs的抑菌活性與其組分密切相關(guān)。實驗結(jié)果表明，S.alboflavus TD-1麥麩培養(yǎng)物產(chǎn)生的VOCs由63種組分組成，其中2-甲基異冰片和1，4二甲基金剛烷的含量相對較高。2-甲基異冰片是一種揮發(fā)性霉味環(huán)叔醇類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有一定的水溶性和脂溶性，在鏈霉菌中普遍存在［15］，且對十字花科植物的種子萌發(fā)有一定抑制作用［16］。有關(guān)1，4-二甲基金剛烷的抑菌作用還未見報道。因此，S.alboflavus TD-1產(chǎn)生的VOCs對灰霉孢菌抑制活性與2-甲基異冰片和1，4-二甲基金剛烷的相關(guān)性還有待深入研究。

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Inhibitory Effect of Volatile Organic Components from Streptomyces Alboflavus TD-1 Against Botrytis Cinerea

LI Zhenjing，ZHANG Chunhui，LU Laifeng，WU Shufen，CHEN Mianhua，HAN Xinnan，WANG Changlu*
（College of Food Engineering and Biological Technology/ Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The antimicrobial effects of the volatile organic components（VOCs）from Streptomyces alboflavus TD-1 on Botrytis cinerea were tested by two-sealed-base-plates method and illustrated by scanning electron micrographs（SEM）.Furthermore，the chemical component of VOCs was analyzed by GC-MS in this study.The results showed that VOCs from S.alboflavus TD-1 grown on autoclaved wheat bran had a certain degree of antifungi activity on the growth of Botrytis cinerea，while the inhibitory ratio reached the strongest with 66.67%after 5 days.The sporulation was significantly inhibited（p＜0.01），and morphological abnormalities，rough surface as well as increased cell membrane permeability were observed after 5 days.Additionally，the main chemical components of VOCs were 2-MIB（13.52%）and 1，4-dimethyl adamantine（14.08%）.All these results suggest that the VOCs from S.alboflavus TD-1 could be developed into a bio-fumigant.

Streptomyces alboflavus；Botrytis cinerea；volatile organic compounds；antibacterial activity

葉紅波）

TS255.3；Q939.95

A

10.3969/ j.issn.2095-6002.2016.03.007

2095-6002（2016）03-0046-07

李貞景，張春慧，路來風，等.白黃鏈霉菌TD-1菌株揮發(fā)性有機物對灰霉孢菌的抑制作用［J］.食品科學技術(shù)學報，2016，34（3）:46 -52.

LI Zhenjing，ZHANG Chunhui，LU Laifeng，et al.Inhibitory effect of volatile organic components from Streptomyces alboflavus TD-1 against Botrytis cinerea［J］.Journal of Food Science and Technology，2016，34（3）:46 -52.

2015-04 -29

李貞景，男，助理研究員，博士，主要從事發(fā)酵食品與微生物資源方面的研究；*王昌祿，男，教授，博士生導師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。通信作者。