血清長鏈非編碼RNA CRNDE-h、GAS5檢測在預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后中的價(jià)值分析

陳　林，葛付濤，沙　輝，葉　龍 ，趙　松，牛　豐*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 脊柱外科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 碎石中心，吉林 長春130021)

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*通訊作者

血清長鏈非編碼RNA CRNDE-h、GAS5檢測在預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后中的價(jià)值分析

陳林1，葛付濤2，沙輝1，葉龍1，趙松1，牛豐1*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 脊柱外科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 碎石中心，吉林 長春130021)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種以局灶性骨病變、軟組織病變及彌漫性骨髓浸潤為主要特征的骨髓惡性漿細(xì)胞疾病。MM患者的主要病變?yōu)楫惓{細(xì)胞的增生，而這種漿細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆免疫球蛋白不具有免疫功能，從而使患者出現(xiàn)了免疫功能降低、骨質(zhì)破壞等病理改變，進(jìn)而形成了骨痛、貧血、腎功能不全、感染、多系統(tǒng)多器官損害等復(fù)雜的臨床表現(xiàn)[1]。雖然中老年人群是MM的多發(fā)人群，但近年來其發(fā)病年齡呈現(xiàn)出了年輕化的趨勢，而且由于MM缺乏特異性的首發(fā)癥狀，因而極易導(dǎo)致誤診或漏診，進(jìn)而對患者的治療效果和預(yù)后產(chǎn)生影響?；熓桥R床上治療MM的主要方法，但化療對于難治性、復(fù)發(fā)性MM患者的療效欠佳，患者的生存期卻未見顯著的延長[2]。因此，臨床上近年來先后研發(fā)了來那度胺、硼替佐米、卡非佐米等新型藥物和序貫自體造血干細(xì)胞移植(AHSCT)、異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)等新型治療方法，相關(guān)研究結(jié)果顯示，這些新型療法在提高M(jìn)M患者的緩解率和生存質(zhì)量等方面均具有一定的價(jià)值[3]，而且MM患者對藥物反應(yīng)的個(gè)體差異較大，這使患者的預(yù)后也存在著較大的差異，對于MM患者的預(yù)后做出及時(shí)、準(zhǔn)確的評價(jià)對于制訂合理的治療方案具有積極的意義。隨著醫(yī)學(xué)科技的不斷進(jìn)步，針對MM的診斷、病情評價(jià)和預(yù)后預(yù)測研究已不再局限于骨髓活檢與影像學(xué)檢查，而是向血清游離輕鏈、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測等方向發(fā)展[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(lncRNA)能夠?qū)φ＜?xì)胞與腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可通過類似癌基因或抑癌基因的作用，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等調(diào)控過程，因此，研究者開始嘗試將lncRNA作為一種標(biāo)志物用于惡性腫瘤的預(yù)后預(yù)測[5]，本研究針對血清lncRNA CRNDE-h、GAS5檢測在預(yù)測MM預(yù)后中的價(jià)值進(jìn)行了觀察和分析，現(xiàn)將研究的具體情況報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1一般資料

選取2009年12月至2010年12月我院收治的80例MM患者作為病例組，納入的患者均符合國際多發(fā)性骨髓瘤工作組(IMWG)2003/世界衛(wèi)生組織(WHO)2008中的MM 診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者的預(yù)計(jì)生存期均超過3個(gè)月，排除合并有其他種類惡性腫瘤、精神疾患及重要器官器質(zhì)性病變的患者。在納入的患者中，男性患者為42例，女性患者為38例，年齡為35至73歲，平均為(56.3±8.1)歲。選取同期在我院接受體檢的健康人80例作為對照組，均經(jīng)臨床檢查排除MM及其他惡性腫瘤，其中，男性為45例，女性為35例，年齡為37至76歲，平均為(57.6±8.7)歲。兩組研究對象的年齡、性別構(gòu)成等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究對象均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2治療方法

對納入的所有MM患者均行4個(gè)療程PAD方案誘導(dǎo)治療，具體方案為硼替佐米1.75mg d1，d4，d8，d11+表柔比星20 mg d1-4+地塞米松 20 mg d1-4，d8-11，以28 d為1個(gè)療程。

1.3觀察指標(biāo)和檢測方法

采集兩組研究對象(病例組患者于接受治療前)的清晨空腹外周血標(biāo)本，提取血清后置于-80℃冰箱中保存待測，應(yīng)用 miRNeasy Serum/Plasma Kit 提取血清總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(q-RT PCR法)定量檢測血清標(biāo)本中的lncRNA CRNDE-h、GAS5水平，以cel-miR-39為內(nèi)參，引物序列見表1，反應(yīng)體系見表2，共反應(yīng)45個(gè)循環(huán)，讀取目的lncRNA及內(nèi)參的循環(huán)閾值(Ct值)，△Ct為目的lncRNA的Ct 值與cel-miR-39的Ct 值的差值，以2-△△Ct表示目的lncRNA的表達(dá)水平；根據(jù)IMWG制定的療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對病例組患者治療2個(gè)療程、4個(gè)療程時(shí)的療效進(jìn)行評價(jià)和比較，主要分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)4個(gè)等級，以療效為CR或PR為臨床有效；對患者進(jìn)行為期4年的隨訪，隨訪方式為電話隨訪及登門隨訪相結(jié)合，對患者的總生存期(OS)和無進(jìn)展生存期(PFS)進(jìn)行觀察和比較。

表1　目的lncRNA引物序列

表2　q-RT PCR反應(yīng)體系

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包建立數(shù)據(jù)庫，計(jì)量資料比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行處理，不同血清lncRNA水平患者的OS、PFS的比較應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析法進(jìn)行處理，LogRank檢驗(yàn)生存期的差異，應(yīng)用Cox回歸進(jìn)行影響生存期的多因素分析，以上統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組研究對象血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達(dá)量的比較

病例組患者的血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達(dá)量均高于對照組，兩組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3　　　兩組研究對象血清lncRNA CRNDE-h、

2.2不同血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達(dá)量MM患者的臨床療效的比較

以病例組患者的血清lncRNA CRNDE-h相對表達(dá)量均數(shù)為界值，將病例組分為CRNDE-h低表達(dá)(40例)和CRNDE-h高表達(dá)(40例)兩個(gè)亞組，以病例組患者的血清lncRNA GAS5相對表達(dá)量均數(shù)為界值，將病例組分為GAS5低表達(dá)(40例)和GAS5高表達(dá)(40例)兩個(gè)亞組，不同血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達(dá)量的MM患者的療效和臨床有效率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4-7。

表4　不同血清lncRNA CRNDE-h相對表達(dá)量MM患者治療2療程時(shí)療效的比較(例，%)

表5　不同血清lncRNA CRNDE-h相對表達(dá)量MM患者治療4療程時(shí)療效的比較(例，%)

表6　不同血清lncRNA GAS5相對表達(dá)量MM患者治療2療程時(shí)療效的比較(例，%)

表7　不同血清lncRNA GAS5相對表達(dá)量MM患者治療4療程時(shí)療效的比較(例，%)

2.3不同血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達(dá)量MM患者的預(yù)后情況的比較

對本組患者的隨訪期截止于2014年12月31日，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，本組MM患者的OS估計(jì)值為31.164個(gè)月，95%CI 為(27.089-35.239)個(gè)月，PFS估計(jì)值為24.835個(gè)月，95%CI 為(21.422-28.249)個(gè)月。CRNDE-h低表達(dá)和CRNDE-h高表達(dá)患者的OS估計(jì)值為37.125個(gè)月和22.575個(gè)月，95%CI 為(31.955-42.295)個(gè)月和(18.589-26.561)個(gè)月，PFS估計(jì)值為29.538個(gè)月和18.237個(gè)月，95%CI 為(25.213-33.864)個(gè)月和(14.224-22.250)個(gè)月，兩亞組患者的OS和PFS的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.876、7.009，P<0.05)。GAS5低表達(dá)和GAS5高表達(dá)患者的OS估計(jì)值為34.030個(gè)月和23.546個(gè)月，95%CI 為(28.717-39.343)個(gè)月和(19.270-27.823)個(gè)月，PFS估計(jì)值為26.794個(gè)月和19.753個(gè)月，95%CI 為(22.255-31.333)個(gè)月和(15.897-23.609)個(gè)月，兩亞組患者的OS和PFS的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.390、1.444，P>0.05)。Cox多元回歸分析結(jié)果顯示，本組患者的OS與血小板減少、乳酸脫氫酶增高、P53缺失、CRNDE-h高表達(dá)均具有相關(guān)性(P<0.05)，PFS與P53缺失、CRNDE-h高表達(dá)均具有相關(guān)性(P<0.05)，見表8、9。

表8　本組患者總生存期(OS)的Cox多因素分析

表9　本組患者無進(jìn)展生存期(PFS)的Cox多因素

3討論

目前，在人類基因中已經(jīng)確定的lncRNA約有10000種[6,7]。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)，某些lncRNA在惡性腫瘤組織及患者血清中呈現(xiàn)特異性高表達(dá)，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖-、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移過程，與腫瘤的發(fā)病、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等臨床治療關(guān)鍵因素密切相關(guān)[8,9]，目前的研究已證實(shí)，lncRNA在惡性腫瘤病理過程中的作用機(jī)制主要包括影響WIF1、PTEN、p21等基因表達(dá)、調(diào)控Wnt、Akt及p53等信號通路、提升E-cadherin和CDH13表達(dá)、降低Vimentin、MMP2和MMP9表達(dá)及影響細(xì)胞周期等[10,11]，因此，lncRNA也被作為特異性標(biāo)志物用于惡性腫瘤的診斷、靶向治療、療效評價(jià)和預(yù)后預(yù)測的研究之中。

CRNDE是ColoRectal Neoplasia Differentially Expressed(結(jié)腸直腸瘤形成差異表達(dá))的基因符號，可轉(zhuǎn)錄為一種多功能lncRNA，在人類和小鼠大腦的特定區(qū)域中表達(dá)，在小鼠直系同源在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，并在神經(jīng)分化中進(jìn)一步增加。CRNDE具有polycomb抑制復(fù)合體2(PRC2)、CoREST染色質(zhì)修飾復(fù)合體等不同剪接形式，這為調(diào)控復(fù)合體提供了特定的功能支架，并形成了非常組織特異性的表達(dá)模式。lncRNA CRNDE與癌癥、神經(jīng)生物學(xué)和發(fā)育等生物學(xué)行為具有密切關(guān)系，它最初被鑒定為一種在結(jié)腸直腸癌中表達(dá)非常高的lncRNA，但隨著研究的不斷擴(kuò)展，相關(guān)研究證實(shí)，這種lncRNA的表達(dá)量也在神經(jīng)膠質(zhì)瘤等許多其他實(shí)體瘤和白血病中是上調(diào)[12]。CRNDE復(fù)雜的選擇性剪接導(dǎo)致了來自該基因具有眾多的轉(zhuǎn)錄本，而在針對癌細(xì)胞的體外試驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)在抑制了GVC-IN4等CRNDE的核轉(zhuǎn)錄本后，可抑制PI3K/Akt/mTOR通路或Raf/MAPK通路兩個(gè)信號通路級聯(lián)的下游靶標(biāo)，進(jìn)而影響許多與胰島素/IGF等相關(guān)基因的表達(dá)[13]。GAS5是Growth Arrest-specific transcript 5(生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5)的基因符號，其內(nèi)含子內(nèi)編碼了多個(gè)ncRNA，而其外顯子序列則轉(zhuǎn)錄出lncRNA[14]，lncRNA GAS5可對糖皮質(zhì)激素及其受體發(fā)揮抑制作用，能夠負(fù)調(diào)控淋巴和乳腺細(xì)胞的存活[15]。目前的研究已證實(shí)，lncRNA GAS5與多種惡性腫瘤的發(fā)病和進(jìn)展具有相關(guān)性，例如，lncRNA GAS5能夠使有效調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的促凋亡活性，GAS5異常的低水平表達(dá)能夠降低前列腺細(xì)胞對化療試劑的反應(yīng)性[16]。相關(guān)研究已顯示，lncRNA GAS5與腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)等惡性腫瘤的預(yù)后具有相關(guān)性[17]，因此，也成為近年來研究較多的與惡性腫瘤預(yù)后相關(guān)的新型分子標(biāo)記物。本研究結(jié)果顯示，病例組患者的血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達(dá)量均高于對照組，不同血清lncRNA CRNDE-h、GAS5相對表達(dá)量的MM患者的療效和臨床有效率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明MM患者可表現(xiàn)為血清lncRNA CRNDE-h、GAS5的高表達(dá)，這兩個(gè)指標(biāo)可提示MM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，可作為MM診斷的血清標(biāo)志物，但其水平與MM的治療效果缺乏相關(guān)性，不能用來評價(jià)治療的臨床療效；血清lncRNA CRNDE-h低表達(dá)患者的OS和PFS顯著長于血清lncRNA CRNDE-h高表達(dá)患者，而不同血清lncRNA GAS5表達(dá)水平的患者的OS和PFS的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，患者的OS與血小板減少、乳酸脫氫酶增高、P53缺失、CRNDE-h高表達(dá)均具有相關(guān)性，PFS與P53缺失、CRNDE-h高表達(dá)均具有相關(guān)性，說明血清lncRNA CRNDE-h的高表達(dá)與MM患者的不良預(yù)后具有相關(guān)性，血清lncRNA CRNDE-h表達(dá)水平可作為預(yù)測MM患者預(yù)后的輔助指標(biāo)。

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文章編號：1007-4287(2016)05-0796-04

(收稿日期：2015-02-14)