新的腫瘤抑素對(duì)C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤體外實(shí)驗(yàn)研究

孫　波，劉嘉婧，劉曉陽(yáng)，孫亞娟，周慶偉，權(quán)　威，陳加俊*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林省食品藥品認(rèn)證中心；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科)

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*通訊作者

新的腫瘤抑素對(duì)C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤體外實(shí)驗(yàn)研究

孫波1，劉嘉婧2，劉曉陽(yáng)3，孫亞娟3，周慶偉1，權(quán)威3，陳加俊3*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林省食品藥品認(rèn)證中心；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)腫瘤，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[1-3]。其傳統(tǒng)的治療原則是術(shù)后先放療后化療，或單獨(dú)放療/化療，但都難以提高其臨床療效[4]，治愈率仍較低。近年來(lái)，研究者們通過(guò)大量的基礎(chǔ)研究正在尋求治療腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新策略。目前國(guó)內(nèi)外已研究出的抗腫瘤藥物眾多，但多數(shù)價(jià)格昂貴且不良反應(yīng)大，同時(shí)也存在耐藥性問(wèn)題，使其臨床應(yīng)用受到一定限制[5-7]。為此，尋找高效、低毒、價(jià)廉的新的治療藥物成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究一種新的腫瘤抑素對(duì)C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的影響，并通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲及細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)變化，初步探討其抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究新的腫瘤抑素在臨床上治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供了新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑及藥品

1.2主要儀器

(1)倒置顯微鏡 NiKon ECLIPSE 80i (日本尼康公司)；(2)二氧化碳培養(yǎng)箱 (日本 三樣電機(jī)株式會(huì)社制造 產(chǎn)品型號(hào)：NCO-15AC)；(3) AN YANG 超凈臺(tái) (中國(guó) 蘇州安洋科技發(fā)展有限公司 型號(hào)：BSC-BOOⅡB2)；(4) Transwell24板由美國(guó)Corning Incorporated生產(chǎn)；(5) 酶標(biāo)儀(中國(guó) 上海BIO-RAD公司，MODEL550型)；凝膠成像系統(tǒng)(中國(guó) 深圳市宇德立生物科技有限公司，170-8170)。

1.3Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力(1) 將Martrigel基質(zhì)膠與DMEM在4冰箱預(yù)冷，將Martrigel基質(zhì)膠與DMEM按1∶7比例充分混勻后加入Traswell小室中，每孔200 μl，置入37℃培養(yǎng)箱20 min，將上層培養(yǎng)基吸出；(2) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6腫瘤細(xì)胞消化﹑計(jì)數(shù)為5×104，每小室加入100 μl細(xì)胞懸液后，隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組，卡莫司汀組，及不同濃度新的腫瘤抑素(1 000 μg/ml﹑1 500 μg/ml﹑2 000 μg/ml)組。(3) 將30%培養(yǎng)液通過(guò)孔隙加入下層中，每孔500 μl。置入37℃、5%CO2孵箱，培養(yǎng)48 h；(4) 棄去上下層培養(yǎng)基，Transwell小室上下層各加入10%甲醛500 μl室溫固定20 min,棄去,500 μl PBS洗兩次后，上下層各加400 μl，1%結(jié)晶紫，20 min后棄去結(jié)晶紫。上下層各用PBS洗2次，末次不棄。(5) 顯微鏡下拍照。

1.4Western Blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白-D1的表達(dá)

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞懸液1×106Cells/ml接種六孔板中，1 ml/孔,37℃、5% CO2培養(yǎng)4 h，(2) 實(shí)驗(yàn)分組(見(jiàn)方法2.1)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，除正常對(duì)照組外，其余每孔加不同的藥物均為500 μl，每孔終體積2 ml。置入37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h；(3)冰上裂解提取細(xì)胞總蛋白，采用BSA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定所提取蛋白的濃度；(4)取50 μg蛋白上樣量，經(jīng)15%的SDS-PAGE電泳，采用電轉(zhuǎn)印法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；(5)膜在5%脫脂奶粉封閉 1 h，加兔抗鼠Cyclin-D1(1∶300)，4℃搖床封閉過(guò)夜；(6)TBST洗滌15 min×3次，加入羊抗兔二抗(1∶3 000)，室溫孵育60 min；(7)TBST洗滌15 min×3次，取等體積ECL顯色A液和B液，加到PVDF膜上，處理1 min后，將膜放入凝膠圖像儀，曝光5 min，特異性條帶的信號(hào)采用凝膠圖像分析系統(tǒng)處理。蛋白表達(dá)灰度值=各組條帶的灰度值/對(duì)應(yīng)的β—actin條帶的灰度值

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同濃度新的腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力具有不同程度的抑制作用。其中新的腫瘤抑素(1 500μg/ml，2 000μg/ml)組及卡莫司汀組與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卡莫司汀組與新的腫瘤抑素(2 000μg/ml)劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1及圖1)。

表1　　　　新的腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的

#P<0.05，與正常對(duì)照組比較;※P>0.05，與卡莫西汀組比較

2.2新的腫瘤抑素對(duì)細(xì)胞周期蛋白-D1表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，不同濃度的新的腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期蛋白-D1的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)作用，正常對(duì)照組與新的腫瘤抑素各組及卡莫西汀組比較均具有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)也顯示，新的腫瘤抑素(2 000 μg/ml)組與卡莫西汀組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明新的腫瘤抑素對(duì)細(xì)胞周期蛋白-D1的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)作用 (見(jiàn)表2及圖2)。

圖1　Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2　　　新的腫瘤抑素對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的

*P<0.05，與正常組比較,ΔP>0.05,與卡莫西汀組比較

圖2　Western Blot檢測(cè)結(jié)果

3討論

近年來(lái)，惡性腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年攀升的趨勢(shì)，在腦腫瘤中以惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率升高最為明顯[8]，約占顱內(nèi)腫瘤的35-60%以上[9]。由于該病的發(fā)病機(jī)理目前仍不清楚，故其治療一直沒(méi)有重大突破。目前主要通過(guò)手術(shù)治療，并聯(lián)合化療、放療以減少腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，但其治愈率仍較低，對(duì)其治療至今尚無(wú)突破性進(jìn)展。故對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效治療手段已成為臨床研究的熱點(diǎn)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)內(nèi)外已研究出的抗腫瘤藥物眾多，但多數(shù)價(jià)格昂貴且不良反應(yīng)大，同時(shí)也存在耐藥性問(wèn)題，使其臨床應(yīng)用受到一定限制[10-12]。為此，尋找高效、低毒、療效穩(wěn)定的抗腫瘤藥物是目前研究開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)，而多肽藥物恰恰具備了這些優(yōu)點(diǎn)。另有研究報(bào)道，增殖和侵襲是惡性腫瘤最為明顯的生物學(xué)特征，也是惡性腫瘤難以治愈的根本原因。如何抑制惡性腫瘤增殖和侵襲對(duì)控制惡性腫瘤進(jìn)展具有重要意義[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果顯示，新的腫瘤抑素(1 500 μL/mL)﹑新的腫瘤抑素(2 000 μL/mL)組分別與正常對(duì)照組比較均具有顯著性差異(P<0.05)。這表明新的腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明顯抑制其侵襲的作用。

多項(xiàng)研究表明，細(xì)胞生長(zhǎng)周期為G1→S→G2→M期，在此細(xì)胞周期中，G1→S期、G2→ M期被認(rèn)為是關(guān)鍵點(diǎn)，并且G1→S期對(duì)細(xì)胞的增殖存在重要影響。Cyclin-D1作為G1期細(xì)胞周期素，在G1/S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用[16]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞進(jìn)入S期后Cyclin-D1迅速分解，若Cyclin-D1基因激活并持續(xù)高表達(dá)，則導(dǎo)致G1期縮短，提前進(jìn)人S期，繼而導(dǎo)致遺傳基因突變和染色體結(jié)構(gòu)異常的細(xì)胞獲得增殖能力，引發(fā)細(xì)胞增殖失控，最終形成腫瘤[17]。本研究為進(jìn)一步探討新的腫瘤抑素對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞周期蛋白-D1表達(dá)的影響。同時(shí)采用Western blot檢測(cè)，結(jié)果也證實(shí)了不同濃度的新的腫瘤抑素對(duì)C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白-D1的表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用，新的腫瘤抑素(1 500 μl/ml)、新的腫瘤抑素(2 000 μl/ml)組及卡莫西汀組與正常對(duì)照組比較均具有顯著性差異(P<0.05)，新的腫瘤抑素(2 000 μg/ml)組與卡莫西汀組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>20.05)。結(jié)果證實(shí)，新的腫瘤抑素可能通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力。本研究為新的腫瘤抑素治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

主要試劑：(1) 結(jié)晶紫由天津光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；(2) 新的腫瘤抑素由本研究室設(shè)計(jì)，由上海吉爾公司合成，純度為98%；(3)卡莫司汀由天津金耀藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：1407011)；Rabbit Anti—Cyclin-D1、HRP羊抗兔IgG、Anti-beta-Actin均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)；PageRuler預(yù)染蛋白Ladder由賽黙飛世爾科技(中國(guó))有限公司生產(chǎn)；RIPA裂解液由碧云天生物技術(shù)研究所(中國(guó))生產(chǎn)。

基金項(xiàng)目：吉林省發(fā)展和改革委員會(huì)課題項(xiàng)目(JF2012C008_4)

文章編號(hào)：1007-4287(2016)05-0707-03

作者簡(jiǎn)介：孫波(1965-)，男，副教授，主要從事藥理學(xué)研究;陳加俊，教授，研究方向：神經(jīng)病學(xué)。

(收稿日期：2015-11-19)