紫外可見分光光度計檢定過程中的注意事項

張宏磊

紫外可見分光光度計是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對物質進行定性和定量分析的儀器。在生物制藥、精細化工、環(huán)境監(jiān)測等領域有著廣泛應用，并被納入《中華人民共和國強制檢定的工作計量器具明細目錄》，需要根據檢定規(guī)程定期檢定。雖然目前檢定機構在檢定紫外可見分光光度計時均嚴格執(zhí)行JJG178-2007《紫外，可見，近紅外分光光度計檢定規(guī)程》，但實際檢定過程中還是經常會出現對同一臺儀器在不同的檢定機構給出的檢定結果并不完全相同，也會有經判定不合格的儀器返廠修理時并未發(fā)現問題的情況。實際上很多時候并不是儀器發(fā)生了問題，只要我們的檢定人員在檢定過程中注意一些細節(jié)的問題，就可以避免誤判情況的發(fā)生。

1 波長示值誤差項目檢定中需注意的問題

波長示值誤差是一項重要指標，規(guī)程中對該項指標的檢測，給出了多種標準物質進行選擇。選擇哪一種標準物質，要根據儀器的情況。一般最常用的波長標準物質是氧化鈥玻璃濾光片、鐠釹玻璃濾光片。因其使用最方便（不用打開儀器光源部分），汞燈等波長標準需放到光源部分，操作起來相對麻煩。但由于氧化鈥玻璃等濾光片需要通過高等級紫外可見分光光度計對參考波長定值后才可用于對相對等級較低的儀器進行檢測，所以使用時需充分考慮定值時使用的紫外可見分光光度計的性能，尤其需要考慮到儀器的光譜帶寬，定值用儀器的光譜帶寬多設定為2nm。但大多數儀器的光譜帶寬是固定的，而且較大，尤其是低檔儀器，如752型紫外可見分光光度計光譜帶寬為4nm。表1、表2分別為同一臺紫外可見分光光度計在其他條件不變下，光譜帶寬分別設定為0.5nm、2.0nm、5.0nm時使用氧化鈥玻璃和鐠釹濾光片掃描得到的峰值數據，可見當儀器的光譜帶寬發(fā)生變化時，使用氧化鈥玻璃或鐠釹玻璃濾光片檢測得到的波長誤差存在著較大的差異，對于光譜帶寬較大的儀器甚至部分波峰檢測不到。而且對于具備自動掃描功能的儀器，掃描速度同樣對檢測結果有著不可忽視的影響。如表3所示。

表1

表2

所以如果我們的定值機構能夠分別給出濾光片在不同光譜帶寬下所對應的峰值，詳細描述定值所用儀器的各項參數。我們的檢定員在檢定過程中根據被檢儀器的實際光譜帶寬選擇合理的參考值，并盡量將儀器掃描速度等參數設定為濾光片定值時所使用的紫外可見分光光度計的參數，將有效避免因定值儀器與被檢儀器因參數設定的差異引入的測量誤差。而且雖然鐠釹玻璃濾光片的波長范圍可以達到（500～900）nm，但并不適合將鐠釹玻璃濾光片作波長示值誤差判定的唯一標準，原因是鐠釹玻璃濾光片的峰值并不尖銳，比較圓滑。僅可作為對某一空白波段的補償。例如使用氧化鈥玻璃濾光片作為主標準器檢測（200～700）nm范圍的波長值，再用鐠釹玻璃濾光片補充（700～900）nm波段的波長值。對于光譜帶寬不可調且較大的儀器如果使用濾光片檢定不合格時切不可急于判定，而應該改用汞燈等自然標準重新對儀器波長誤差進行檢定，以此為依據做出判斷。

表3

2 透射比示值誤差檢定中需注意的問題

透射比的誤差反映了儀器測光的準確度，使用的標準器通常為：標準溶液、金屬鍍膜濾光片和中性濾光片。實際檢定中多使用金屬鍍膜濾光片和中性濾光片，其中金屬鍍膜濾光片可以滿足紫外光段和可見光段的檢定，中性濾光片僅可滿足可見光段的檢定。檢定中經常會發(fā)現部分單光束低端儀器（如721型分光光度計）透射比示值誤差超差的現象，實際上造成這種結果可能是由下列原因造成的：

2.1 分光光度計入射光的光斑較大

大部分單光束紫外可見分光光度計入射光的光斑較大，用濾光片檢定時，濾光片的支架的邊緣遮擋了部分光，造成檢定結果超差。解決方法：以空氣為參比，對分光光度計透射比調節(jié)100%時，在比色皿中插入未安裝濾光片的空白支架。

2.2 檢定用濾光片對光的反射引起的誤差

這種現象主要發(fā)生在使用金屬鍍膜濾光片檢定儀器透射比誤差時。用于檢定儀器透射比誤差的理想濾光片應能夠均勻的降低入射光的強度，不存在對入射光的反射。但目前所使用的金屬鍍膜濾光片的表面均會對入射光產生一定的反射，造成測量誤差，這個現象在對使用透鏡式光路的低端紫外可見分光光度計檢定中尤其明顯。而且金屬鍍膜濾光片存在計量性能不穩(wěn)定的問題，由于該濾光片表面是一層鍍膜，如果鍍膜表面受到污染，在進行清理時是很容易對鍍膜造成破壞，改變?yōu)V光片原有數值的。解決方法：使用金屬鍍膜濾光片對紫外光段的透射比誤差進行檢定，使用中性濾光片對可見光段的透射比誤差進行檢定，當發(fā)現僅紫外光段透射比誤差不合格時，使用標準溶液進行復測，以標準溶液的檢定結果作為紫外光段透射比誤差的最終檢定結果。

2.3 檢定用濾光片入射面選擇所造成的誤差

由于濾光片制作工藝水平的限制，濾光片的厚度不可能是完全均勻的，更不能保證濾光片放入比色皿架后，入射光能夠完全垂直照射在濾光片上，這就造成同一個濾光片，選擇的入射面不同時，測得的透射比示值也是不同的，造成測量誤差，甚至誤判。解決方法：對濾光片定值時，如果定值機構在定值時能夠考慮到這個問題，根據定值時的實際情況在濾光片上標明入射光的方向或入射面，檢定儀器時根據定值機構的標注選擇濾光片入射面，放置濾光片，就可以有效減小因濾光片入射面選擇不同造成的測量誤差。

3 雜散光檢定中需要注意的項目

雜散光是紫外可見分光光度計非常重要的關鍵技術指標。它是紫外可見分光光度計分析誤差的主要來源，它直接限制被分析測試樣品濃度的上限。當一臺紫外可見分光光度計雜散光一定時，被分析的試樣濃度越大，其誤差分析就越大。雜散光的檢測可以使用10g/L的NaI碘化鈉溶液和50g/L的NaNO2亞硝酸鈉溶液，也可以使用截止濾光片，只要該片在某區(qū)域的透射比（或吸光度）值與檢定規(guī)程中的指標符合誤差理論（標準器與被檢器的關系）即可。

雜散光的來源有很多，主要有一下幾個方面1灰塵污染光學元件，2光學元件被損傷或有其他缺陷，3光學系統(tǒng)屏蔽不好，4狹縫的缺陷等，其中光柵是雜散光的主要來源，它產生的雜散光占總雜散光的80%以上。雜散光一般有兩種出現形式：一是，被測量波長和雜散光波長相同，會直接射到檢測器上，而沒有經過樣品。造成這種情況的主要原因是樣品與其他光學接線零件的散射即反射。二是，雜散光是測定波長之外的偏離正常光路到達檢測器的光線，這是因光學系統(tǒng)本身缺陷導致，比如灰塵散射、光學系統(tǒng)像差、多余反射面等。在檢定雜散光時，標準濾光片法在實際檢定中運用比較多，在光譜透光率的檢測器靈敏度較低、光強強度較弱時，會加大雜散光比例，因此，首先應該對紫外分光光度計中（200～220）nm區(qū)域內的雜散光進行檢定。

4 小結

總之，在紫外分光光度計檢定過程中需要注意的事項很多，上文主要是介紹了紫外可見分光光度計的波長示值誤差、透射比示值誤差差是檢定過程中最重要的三個檢定中注意的事項和雜散光的問題，而且這三個檢定項目在檢定過程中很容易因一些檢定中的細節(jié)問題注意不夠造成誤判，以上主要介紹了在檢定過程中對以上三個項目在檢定過程中的一些體會和經驗，希望能夠對我們的檢定員在日常檢定中有所幫助。另外，也要重視電源電壓適應性與吸收池配套性的影響，分析造成誤差的原因，找到解決措施。同時在使用紫外分光光度計的過程中，也要做好儀器的日常維護工作，只有做好方方面面的工作，才能確保紫外分光光度計保持最佳的工作狀態(tài)。

[責任編輯：湯靜]