桔梗皂苷D經(jīng)NF-κB通路抑制炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷*

裴彩霞， 王振興， 汪曉敏， 吳永燦， 黃德美， 楊 琪， 王 飛 ，2△

（1成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610075；2四川中醫(yī)藥高等?？茖W校，四川 綿陽 621000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是以嚴重的動脈低氧血癥、肺水腫和肺內(nèi)中性粒細胞聚積為病理特征的肺部炎癥性綜合反應(yīng)［1］，嚴重者可轉(zhuǎn)為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ALI/ARDS 在重癥監(jiān)護室是導(dǎo)致急性呼吸衰竭的主要原因［2］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的一種成分，內(nèi)毒素休克或內(nèi)毒素所致的ARDS 是常見的肺部炎癥綜合征。內(nèi)毒素引起的嚴重ALI 常常難以控制或治療，死亡率常高達40%［3-4］。盡管ALI/ARDS的發(fā)病機制及治療有了顯著性進展，但目前仍然局限于機械性通氣、抗炎、抗氧化、激素療法及干細胞療法等［5］，而由這些治療方法帶來的副作用及局限性，如呼吸機相關(guān)性肺損傷、過敏反應(yīng)、異質(zhì)性等嚴重限制了西醫(yī)學的發(fā)揮空間，也嚴重影響了患者的健康生活質(zhì)量。因此，積極研究ALI/ARDS 的發(fā)病機制，探索潛在的中醫(yī)藥干預(yù)方法至關(guān)重要。

桔梗為桔梗科植物桔梗的根，入肺經(jīng)，具有宣肺利咽、祛痰排膿的功效。在中國、韓國和日本一直被用于防治各種肺損傷、支氣管炎、喉炎和扁桃體炎的重要藥物［6］。桔梗的主要藥理成分桔梗皂苷D（platycodin D，PLD）具有多種藥理活性，如抗炎、抗癌，抗傷害性和免疫調(diào)節(jié)性［7-10］，但其防治 LPS 誘導(dǎo)的ALI的具體機制尚不清楚。既往研究表明，LPS可通過增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成而引起氧化應(yīng)激［11-12］，ROS過度積聚可引起肺水腫和過度的炎性細胞浸潤，從而導(dǎo)致ALI。氧化應(yīng)激是氧自由基產(chǎn)生與體內(nèi)抗氧化能力失衡所致，可誘導(dǎo)炎癥細胞聚集，參與到ALI 的病理過程［13］。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是炎癥信號通路，是啟動炎癥反應(yīng)的傳感器，在ROS 和促炎因子等的刺激下可以被激活［13］。本實驗采用LPS 氣道滴注復(fù)制ALI大鼠模型，觀察肺組織病理、炎癥因子水平、氧化應(yīng)激反應(yīng)及NF-κB 通路蛋白表達情況，探討PLD 對ALI大鼠的抗炎作用及保護機制。

材料和方法

1 動物

SPF 級 SD 雄性大鼠 42只，6 周齡，體質(zhì)量 130~150 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證號SCXK（川）2015-030，自由進食水。本研究所有動物實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學倫理委員會批準，倫理審查編號2017-03，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2015-179。

2 主要試劑

PLD（瑞芬思生物科技有限公司；經(jīng)HPLC 檢測，純度≥98%）；LPS（Sigma）；地塞米松（dexamethasone，Dex；天津金耀藥業(yè)有限公司）；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、微量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；白細胞介素1β（IL-1β）、IL-18、IL-6 和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；兔多抗p-p65 及兔單抗IκB 和GAPDH（Abcam）；兔單抗p65 和 p-IκB（Cell Signaling Technology）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG Ⅱ抗（武漢賽維爾公司）。

3 主要方法

3.1 動物分組及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機數(shù)表法將42只SD 大鼠分為6組：假手術(shù)（sham）組、PLD 對照組（PLD組）、模型（model）組、低劑量 PLD（low-dose PLD，PLD-L）組、高劑量 PLD（high-dose PLD，PLD-H）組和 Dex組，每組 7只。PLD 給藥劑量運用體表面積法計算并結(jié)合文獻所得［6，14-15］，低、高劑量分別為12.5 和 25 mg/kg，以含有1‰ DMSO 的無菌生理鹽水混懸，于造模前按5 mL/kg 的給藥體積進行腹腔注射，注射前以醫(yī)用酒精消毒注射部位，每天一次，連續(xù)給藥5 d；PLD組給予25 mg/kg PLD，未造模；Dex組為陽性對照組，Dex 充分溶于無菌生理鹽水，于造模后1 h 按2.5 mL/kg 的給藥體積腹腔注射給藥［16］，造模后給藥是為了充分評價PLD 對肺損傷的保護作用；sham組和model組腹腔注射等體積含有1‰DMSO的無菌生理鹽水。

3.2 ALI 模型 參考文獻介紹的方法并結(jié)合預(yù)實驗［6，17］，本次實驗采用氣管滴注 LPS 的造模方法制備大鼠ALI 模型。LPS 充分溶解于無菌生理鹽水。末次給藥30 min后，各組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）進行麻醉。完全麻醉大鼠后，將其仰臥位固定于30°坡度手術(shù)臺，剪開前頸部皮膚，暴露氣管。除sham組及PLD組外，其余各組氣管內(nèi)緩慢注射LPS（劑量為5 mg/kg，滴注體積為1 mL/kg）誘發(fā)大鼠ALI 模型，sham組和PLD組氣道滴入等體積無菌生理鹽水。造模24 h后，處死大鼠并采集標本。

3.3 指標觀察及標本采集 實驗期間，觀察并記錄造模前后大鼠的精神狀態(tài)、活動、飲食、呼吸、被毛色澤等情況，并記錄大鼠的死亡情況。于造模后24 h用1%戊巴比妥鈉“安死術(shù)”［18］劑量（150 mg/kg）處死大鼠，腹主動脈取血，4 ℃、1 500×g離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。分離肺組織，左肺立即放入液氮中快速凍存，隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱貯藏行Western blot 實驗；右肺用于病理與肺濕/干重（wet/dry weight，W/D）比的檢測。

3.4 肺W/D 比 取新鮮右肺組織稱重即為濕重（W），將其放入60 ℃干燥箱烘烤48 h 后稱重得干重（D），計算肺組織W/D即為肺W/D比。

3.5 HE 染色 觀察肺組織病理變化將肺組織放入4%多聚甲醛固定液固定24 h 后，進行常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片4 μm，二甲苯脫蠟，HE 染色。倒置光學顯微鏡下觀察肺組織病理改變并采用Mc-Guigan 病理評分法［19］進行評分，依據(jù)肺泡充血，出血，肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集，肺泡壁增厚或透明膜形成4 項指標，在光鏡下，每個樣本隨機抽取5 個視野（×200）對以上4 項指標進行半定量分析（0 分：無病變或非常輕微；1 分：輕度病變；2 分：中度病變；3分：重度病變；4分：極重度病變）。

3.6 ELISA 檢測大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6 含量 取出凍存的大鼠血清，ELISA 法測定血清IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6 的含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。將孔板置于酶標儀上，設(shè)定波長為450 nm，測定IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6的吸光度，最后按照說明書繪制標準曲線，計算血清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的含量。

3.7 血清 MDA 含量及 MPO、CAT、GSH 和 GSH-Px活性測定 取大鼠血清，按照試劑盒說明書，TBA 法測定MDA 含量，比色法測定MPO 及GSH-Px活性，可見光法測定CAT活性，微板法測定GSH活性。

3.8 Western blot 檢測肺組織中 NF-κB 通路主要蛋白的表達 用含有PMSF、磷酸酶抑制劑和Cocktail的RIPA 裂解液提取肺組織蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白置于沸水中使其變性，然后將蛋白進行SDS-PAGE，各組總蛋白含量為70 μg。之后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，以5%脫脂牛奶或5%小牛血清室溫封閉1 h。加Ⅰ抗（p65和p-p65，1∶5 000；IκB，1∶500；p-IκB，1∶1 000；內(nèi)參照 GAPDH，1∶10 000），4 ℃孵育過夜。PBST 洗滌 3 次，每次 10 min，以 HRP標記的Ⅱ抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，Ⅱ抗孵育結(jié)束后，用 PBST 洗滌 3 次，每次 5 min。用 ECL 化學發(fā)光液顯影，然后使用Universal Hood II 型凝膠成像系統(tǒng)成像，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件測定相關(guān)蛋白的灰度值。

4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD法，方差不齊時用 Duunett＇s T3 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 一般情況

本次實驗過程中無大鼠死亡。其中，sham組精神狀態(tài)良好，活動正常，反應(yīng)靈敏，呼吸平穩(wěn)，毛色光澤，飲食飲水均無異常；造模24 h后，model組大鼠精神萎靡，行動遲緩，被毛粗亂無光，毛色灰暗，飲食飲水明顯減少，呼吸急促，偶有喘鳴音，唇舌黏膜紫暗，可見團聚現(xiàn)象；PLD-L組、PLD-H組和 Dex組大鼠的精神狀態(tài)、活動量、被毛色澤、唇舌黏膜等一般情況有所改善，呼吸急促，但無喘鳴音，飲食飲水基本恢復(fù)正常，其中以PLD-H組和Dex組情況改善顯著。

2 PLD對ALI大鼠肺W/D比的影響

與 sham組比較，model組大鼠肺 W/D 比顯著升高（P＜0.01）；與model組比較，PLD-L組、PLD-H組和Dex組大鼠肺 W/D 比均顯著降低（P＜0.01），且以PLD-H組和Dex組效果較好，見圖1。

3 PLD對ALI大鼠肺組織病理學的影響

Figure 1. Effect of platycodin D（PLD）on lung wet/dry weight（W/D） ratio in ALI rats. Mean±SEM. n=7.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs model group.圖1 桔梗皂苷D對ALI大鼠肺W/D比的影響

HE染色結(jié)果顯示，sham組和PLD組肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡大小正常，肺泡壁薄，氣道黏膜未見損傷，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)偶見少量中性粒細胞；model組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，肺泡壁明顯增厚，肺泡間隔變寬，間隔內(nèi)毛細血管擴張充盈，氣道黏膜損傷明顯，肺間質(zhì)水腫，肺泡腔、肺泡間隔及肺間質(zhì)內(nèi)可見出血、滲出和以中性粒細胞為主的大量炎癥細胞浸潤，支氣管管壁增厚；而PLD 不同劑量預(yù)處理及Dex 治療后，肺損傷均有不同程度的減輕：炎性滲出物減少，肺泡壁增厚不明顯，肺間質(zhì)水腫減輕。其中PLD-L組肺泡腔和肺泡間隔內(nèi)中性粒細胞比PLD-H組增多，肺泡壁比PLD-H組增厚，肺間質(zhì)水腫程度較重。各藥物干預(yù)組中以PLD-H組和Dex組改善效果明顯。肺損傷評分結(jié)果顯示，與sham組比較，model組肺損傷嚴重（P＜0.01）；與model組比較，PLD-L組、PLD-H組和Dex組肺損傷均有不同程度的減輕（P＜0.01），其中以PLD-H組和Dex組情況改善顯著。見圖2。這表明，采用LPS 誘導(dǎo)大鼠ALI 模型成功，而PLD預(yù)處理和Dex治療后可明顯減輕肺組織損傷。

Figure 2. Effect of platycodin D（PLD）on histopathological changes of the lung tissues in rats（HE staining，scale bar=50 μm）.Mean±SEM. n=7.##P＜0.01 vs sham group，**P＜0.01 vs model group.圖2 桔梗皂苷D對大鼠肺組織病理學及肺損傷評分的影響

4 PLD 對 ALI 大鼠血清 IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6含量的影響

與sham組比較，model組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6含量均顯著上升（P＜0.01）；與model組比較，PLD-L組、PLD-H組和 Dex組大鼠血清 IL-1β、IL-18、TNF-α和 IL-6 含量均顯著下降（P＜0.01），見圖3。

5 PLD 對 ALI 大鼠血清 MDA 含量及 MPO、CAT、GSH和GSH-Px活性的影響

與 sham組比較，model組 MDA 含量及 MPO 活性均顯著升高（P＜0.01），CAT、GSH 及GSH-Px 活性均顯著降低（P＜0.01）；與model組比較，PLD-L組、PLDH組和 Dex組 MDA 含量及 MPO 活性顯著下降（P＜0.01），CAT、GSH 及 GSH-Px 活性均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。

Figure 3. Effects of platycodin D（PLD）on the serum levels of IL-1β，IL-18，TNF-α and IL-6 in ALI rats. Mean±SEM. n=7.##P＜0.01 vs sham group，**P＜0.01 vs model group.圖3 桔梗皂苷D對ALI大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6含量的影響

6 PLD 對 ALI 大鼠肺組織 p65、p-p65、IκB 和 p-IκB蛋白表達的影響

與 sham組比較，model組 p-p65/p65 和 p-IκB/IκB的蛋白比值均顯著升高（P＜0.01）；與model組比較，PLD-H組和Dex組p-p65/p65的蛋白比值均顯著降低（P＜0.01），p-IκB/IκB 的蛋白比值也顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖5。

討 論

LPS 誘導(dǎo)的ALI 動物模型已被廣泛應(yīng)用于ALI發(fā)病機制的研究［20］。本實驗采用氣管內(nèi)滴注LPS 誘導(dǎo)大鼠ALI 模型，實驗結(jié)果表明，LPS 誘發(fā)了大鼠肺組織損傷，升高了肺W/D 比值，肺含水量顯著增加。肺W/D 比是全身和局部炎癥的典型癥狀［21］，這表明此次ALI模型成功復(fù)制。低、高劑量PLD和Dex均可有效減輕肺組織損傷，降低肺W/D 比值，且以高劑量PLD和Dex效果顯著。

促炎細胞因子的產(chǎn)生在ALI 的發(fā)病機制中起著重要的作用［22］。LPS 可誘導(dǎo)中性粒細胞和巨噬細胞的大量浸潤，從而誘導(dǎo)多種炎性和趨化性細胞因子的產(chǎn)生，如 IL-1β、IL-18、TNF-α 和 IL-6 等［23］，這些細胞因子以及其他促炎性化合物參與了ALI 炎癥反應(yīng)的啟動、擴增和持續(xù)［6］。我們的研究結(jié)果符合以上結(jié)論，結(jié)果顯示，LPS 誘導(dǎo)了炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α 和 IL-6 的分泌，低、高劑量 PLD 和 Dex 抑制了這些炎性因子的分泌，并以高劑量PLD 和Dex 效果顯著，提示PLD保護LPS誘導(dǎo)大鼠ALI的作用可能與抑制炎癥有關(guān)。

既往大量的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激參與了ALI 的發(fā)病機制［24］。MDA 和 MPO 是氧化應(yīng)激的標志物［25］，CAT、GSH 和GSH-Px 是重要的抗氧化劑，可清除脂質(zhì)過氧化物自由基［16］。先前研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以升高MDA 濃 度 和 MPO 活 性 ，降 低 CAT 和 GSH-Px 活性［26-28］。與這些研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果顯示，LPS 顯著增加了MDA 含量和MPO 活性，降低了CAT、GSH 和 GSH-Px 活性。用低、高劑量 PLD 和 Dex干預(yù)后，MDA 含量及 MPO 活性降低，CAT、GSH 和GSH-Px 活性升高，且以高劑量PLD 和Dex 的效果為佳。這提示PLD 保護LPS 誘導(dǎo)大鼠ALI 的作用可能與抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

Figure 4. Effects of platycodin D（PLD）on the serum levels of MDA（A），MPO（B），CAT（C），GSH（D）and GSH-Px（E）in ALI rats. Mean±SEM. n=7.##P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖4 桔梗皂苷D對ALI大鼠血清MDA含量及MPO、CAT、GSH和GSH-Px活性的影響

Figure 5. Effects of platycodin D（PLD）on the p-p65/p65（A）and p-IκB/IκB（B）protein levels in the lung tissue of ALI rats.Mean±SEM. n=7.##P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖5 桔梗皂苷D對ALI大鼠肺組織中p-p65/p65及p-IκB/IκB蛋白水平的影響

NF-κB 是誘導(dǎo)炎癥的主要轉(zhuǎn)錄因子，被廣泛證明參與ALI的病理過程［29］。以往研究表明，LPS 可誘導(dǎo)大鼠肺組織 NF-κB 的活化［30］。本研究結(jié)果顯示，氣道滴注 LPS 后，大鼠肺組織中 NF-κB p65 和 IκB 蛋白的磷酸化水平升高，說明NF-κB 被活化。研究表明，Dex 可以抑制 LPS 誘導(dǎo)的 NF-κB 的活化［31］。PLD是桔梗的主要藥理成分，具有抗炎、祛痰、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛的功效。前期已有文獻報道，PLD 可抑制LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細胞 TNF-α 和 IL-1β 的釋放［32］，進而抑制NF-κB的活化［33］。此外，還表明PLD通過抑制NF-κB 活化來減輕慢性氣道炎癥［14］。本實驗研究結(jié)果顯示，PLD 和Dex 均能有效降低大鼠肺組織中p65 及IKB 蛋白的磷酸化水平，提示在LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI模型中，PLD 可能通過抑制NF-κB 信號通路的活化來發(fā)揮對肺損傷的抑制作用。

綜上所述，PLD 預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠肺組織具有保護作用，其機制可能是通過抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而抑制促炎細胞因子產(chǎn)生和減輕氧化應(yīng)激損傷。