超聲波輔助法和乙醇回流法提取葛根素

王振偉，胡曉冰，陳西良（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，應(yīng)用化學(xué)研究中心，河南開封475000）

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超聲波輔助法和乙醇回流法提取葛根素

王振偉，胡曉冰，陳西良
（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，應(yīng)用化學(xué)研究中心，河南開封475000）

摘要：用乙醇做溶劑，分別采用超聲輔助法和回流法從葛根中提取有效成分葛根素，考察了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、固液比、乙醇濃度等因素對提取率的影響，并采用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明，乙醇回流法提取葛根素的最佳工藝條件為：乙醇濃度75%，提取溫度90℃，提取時(shí)間90 min，固液比為1∶20（g/mL），葛根素的提取率為86.20%；超聲波輔助法提取葛根素的最佳工藝條件為：乙醇濃度60%，提取溫度80℃，固液比為1∶20（g/mL），提取時(shí)間50 min，葛根素的提取率為95.85%。超聲波輔助提取的提取率明顯高于乙醇回流法。

關(guān)鍵詞：葛根素；超聲波；回流

葛根素屬于異黃酮類化合物，是葛屬植物的特征成分。葛根素具有廣泛的藥理活性，特別其是對心血管疾病具有良好的療效，因此具有重要的醫(yī)療和保健價(jià)值［1］。

目前葛根素的提取方法主要有浸漬法、醇回流法、微波法、超聲法、超臨界萃取法等。潘見［2］和李穩(wěn)宏等人［3］分別采取醇浸取和醇回流的方法優(yōu)化葛根黃酮提取工藝，取得了較高的提取率，并且固液分離過程也比水提法容易得多。李芙蓉［4］首次運(yùn)用微波法從葛根中提取總黃酮，測得葛根中總黃酮含量為0.34%，平均回收率達(dá)到97.6%。王龍虎等人［5］采用超臨界流體萃取的方法，系統(tǒng)地考察了原料、溫度、壓力、CO2流量、萃取時(shí)間和共溶劑用量等條件對提取率的影響。相比而言，微波法、超臨界流體萃取等方法可以得到較高的提取率，并且耗時(shí)少，但是需要特殊的設(shè)備；浸取法和醇回流法所需儀器簡單，更加容易滿足，但是所需的時(shí)間較長。

超聲波的空化作用可以產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力，從而使植物細(xì)胞壁破裂，有助于有效成分的溶出與釋放；超聲波的振蕩和加熱作用，有利于溶質(zhì)擴(kuò)散［6］，從而提高提取率，但是目前采用超聲法提取葛根素的研究相對于其它幾種方法還不夠完善［7-8］。本文采用醇回流法和超聲波輔助法從葛根中提取葛根素，系統(tǒng)研究提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、固液比等因素對提取率的影響，正交試驗(yàn)優(yōu)化乙醇回流提取工藝和超聲輔助提取工藝，為葛根中葛根素的開發(fā)和利用提供試驗(yàn)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葛根：河南省開封市醫(yī)藥大廈；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：西安中鑫生物技術(shù)有限公司；無水乙醇：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；D101大孔吸附樹脂：開封化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：河南智誠科技發(fā)展有限公司；超聲波組織粉碎儀：南京先歐儀器制造有限公司。

1.3方法

D101型大孔吸附樹脂用無水乙醇充分溶脹裝柱，依次用乙醇、去離子水洗凈備用。葛根干燥、粉碎、過100目篩后備用。

稱取一定量粉碎后的葛根置于回流裝置內(nèi)，分別在固液比為1∶20（g/mL）、乙醇濃度70%、回流時(shí)間120 min的情況下研究反應(yīng)溫度對提取效果的影響；在固液比1∶20（g/mL）、乙醇濃度70%、反應(yīng)溫度80℃情況下研究不同的回流時(shí)間對提取效果的影響；在乙醇濃度70%、反應(yīng)溫度90℃、回流時(shí)間120 min情況下研究不同的固液比對提取效果的影響；在固液比1∶20（g/mL）、反應(yīng)溫度80℃、回流時(shí)間120 min情況下研究不同的乙醇濃度對提取效果的影響。回流完畢后抽濾，所得澄清溶液用D101大孔吸附樹脂分離純化，測定葛根素含量，計(jì)算提取率。超聲輔助法提取葛根素時(shí)，將裝有葛根素和乙醇溶液的回流裝置放入超聲水浴中，設(shè)置超聲波功率為200 W，其它步驟與醇回流法相同。

葛根中葛根素含量的測定參照文獻(xiàn)［9］，稱取10 g葛根以80%乙醇回流提取，過濾后的濾渣繼續(xù)回流提取，直至提取液中檢測不到葛根素為止，將所得提取液合并，即可得到葛根中葛根素的總量，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葛根素的含量為38.021 mg/g。

精密稱取干燥的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg溶解于50 mL 95%乙醇中配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，量取1 mL于10 mL比色管中用95%乙醇稀釋定容后做光譜掃描分析，葛根素標(biāo)準(zhǔn)品的紫外可見吸收光譜如圖1所示。

圖1　葛根素溶液的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis spectrum of puerarin solution

葛根素對在紫外區(qū)250 nm處具有穩(wěn)定的特征吸收峰［10］。

分別量取葛根素對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于8支10 mL閉塞管中，用95%乙醇定容，在250nm處測定其吸光度，以葛根素濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=6.820 5C+0.132，R2=0.994，其中A為吸光度，C為葛根素的濃度。

圖2　葛根素溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of puerarin solution

2　結(jié)果與討論

2.1乙醇回流法提取試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1乙醇回流單因素試驗(yàn)

以葛根素提取率為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，乙醇回流法提取時(shí)間對提取率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3　時(shí)間對葛根素提取率的影響Fig.3 Effects of time on extraction rate

隨著提取時(shí)間的增加，提取率不斷地增加，并且在120 min時(shí)提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)延長提取時(shí)間，葛根素的提取率反而下降，這可能是葛根素的水解反應(yīng)所致。120 min左右的時(shí)間，葛根素的溶解、析出已經(jīng)達(dá)到平衡，過度延長時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生，使部分葛根素發(fā)生分解，從而降低了提取率。因此，最佳的提取時(shí)間為120 min。

圖4　溫度對葛根素提取率的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction rate

由圖4可知，葛根素得率隨反應(yīng)溫度的升高而不斷增大，這是因?yàn)闇囟鹊奶岣呖杉觿》肿拥倪\(yùn)動(dòng)，促進(jìn)水解反應(yīng)，促進(jìn)葛根素的溶出。溫度增加到一定程度后，葛根素的浸出量幾乎達(dá)到飽和。

乙醇濃度對提取率的影響如圖5所示。

圖5　乙醇濃度對葛根素提取率的影響Fig.5 Effects of ethanol concentration on extraction rate

隨著乙醇濃度的增大，葛根素提取率不斷增大，但增加的幅度不大。但當(dāng)乙醇濃度超過80%時(shí)，提取率急劇減小。這是由于乙醇和水均屬于極性溶液，水的極性大于乙醇。隨著乙醇比例的增大，溶液的極性不斷減小，導(dǎo)致提取溶劑對葛根素的溶解度降低。試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，提取液的混濁度隨乙醇濃度的增大而減小。這是由于在葛根的有效成分中，另一種重要成分葛根多糖同樣具有水溶性，在低濃度乙醇溶液中容易被提取出來，故提取液比較渾濁，而在高濃度乙醇溶液中，多糖的溶解度降低，導(dǎo)致溶液較為透明。綜合考慮認(rèn)為，以80%乙醇為提取劑提取葛根素，不但有利于葛根素的浸出，而且可以抑制其它物質(zhì)的溶解。

葛根素的提取率隨固液比的增大而增大，如圖6所示。

圖6　固液比對葛根素提取率的影響Fig.6 Effects of liquid-solid ratio on extraction rate

當(dāng)固液比達(dá)到1∶30（g/mL）后，提取率開始呈現(xiàn)下降的趨勢。考慮到采用較大的固液比時(shí)，不僅增加了乙醇的用量，還增大了濃縮分離等工序的難度，故選用1∶30（g/mL）的固液比作為最優(yōu)選擇。

2.1.2乙醇回流正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

為了確定在提取過程中各因素的影響大小，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取固液比、乙醇濃度、提取溫度、加熱回流時(shí)間作為考察因素，以葛根素提取率為指標(biāo)，各取4個(gè)水平，進(jìn)行L16（44）正交試驗(yàn)，以確定乙醇回流法提取葛根中葛根素的最佳工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1。

表1　L16（44）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 L16（44）Factors and levels of orthogonal test design

按照表1設(shè)計(jì)的因素和水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算提取率結(jié)果如表2所示。

正交試驗(yàn)的R值分析結(jié)果顯示：以葛根素提取率為評價(jià)指標(biāo)，各因素對提取效果的影響程度依次為：乙醇濃度＞溫度＞固液比＞時(shí)間。綜合分析正交試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳提取組合為A1B2C3D3，即最佳提取工藝條件為固液比1∶20（g/mL），乙醇濃度75%，時(shí)間90 min，溫度90℃。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在此條件下得到葛根素的提取率為86.20%。

2.2超聲波輔助提取試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1超聲波單因素試驗(yàn)及分析

在200 W超聲功率下，以葛根素提取率為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行超聲波輔助提取葛根素的單因素試驗(yàn)，乙醇濃度對提取率的影響如圖7所示。

表2　乙醇回流提取葛根素的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of extracting puerarin via alcohol refluxing method

圖7　乙醇濃度對葛根素提取率的影響Fig.7 Effects of ethanol concentration on extraction rate

隨著乙醇濃度的增大，葛根素提取率不斷增大。當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，提取率達(dá)到極大值，當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大時(shí)提取率反而急劇減小，所以選擇乙醇濃度為65%。超聲波可以有效地提高提取率，隨著時(shí)間的增大，提取率也在增加（如圖8所示）。

圖8　時(shí)間對葛根素提取率的影響Fig.8 Effects of ultrasonic time on extraction rate

但在超聲時(shí)間超過60 min后，提取率反而下降，原因是超聲波空化破碎作用可以在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的提取率。由于反應(yīng)時(shí)間相比回流法短，可以有效降低葛根素的降解，所以提取率比回流法有所提高。在60 min后，由于葛根素的降解使提取率下降。

超聲溫度對提取率的影響如圖9所示。

圖9　溫度對葛根素提取率的影響Fig.9 Effects of temperature on extraction rate

隨著溫度升高，葛根素的提取率不斷提高。當(dāng)溫度超過70℃時(shí)，提取率升高的幅度變緩，原因主要是葛根富含淀粉，溫度過高容易產(chǎn)生糊化，不利于葛根素的溶出。

葛根素的提取率隨固液比的變化如圖10所示。

圖10　固液比對葛根素提取率的影響Fig.10 Effects of liquid-solid ratio on extraction rate

隨著固液比的增加，對葛根素的溶出更加充分，因此提取率增大。但是當(dāng)固液比超過1∶40（g/mL）時(shí)，提取率開始降低。這是由于超聲波在溶液中傳播時(shí)，聲波的能量隨著傳播距離的增加急速衰減。隨著固液比的增加，體系中總的溶液體積增大，在距離聲源較大的距離處，超聲波能量降低，空化能力削弱，不利于葛根素的溶出。另外，液體對超聲波的吸收衰減，也是導(dǎo)致超聲波隨體系增大而快速衰減的原因。

2.2.2超聲波輔助正交試驗(yàn)

為了確定在超聲波輔助提取過程中各因素對提取結(jié)果影響的大小，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取固液比、乙醇濃度、提取溫度、加熱回流時(shí)間作為考察因素，在200 W的超聲波功率下，以葛根素提取率為指標(biāo)，各取4個(gè)水平，進(jìn)行L16（44）正交試驗(yàn)，以確定葛根中的葛根素最佳提取工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表3。

表3　L16（44）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 3 L16（44）Factors and levels of orthogonal test design

按照表3設(shè)計(jì)的因素和水平進(jìn)行正交試驗(yàn)測定，方法同上，經(jīng)計(jì)算提取率結(jié)果如表4所示。

表4　超聲波輔助法回流提取葛根素的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of extracting puerarin via ultrasonic method

通過正交試結(jié)果的分析，影響試驗(yàn)效果的因素依次是：固液比＞乙醇濃度＞溫度＞時(shí)間。由此可確定最優(yōu)的試驗(yàn)條件為固液比1∶20（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲波時(shí)間為50 min，超聲波浸提的溫度80℃。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證在此條件下可得到葛根素的提取率為95.85%。采用超聲波輔助提取葛根有效成分，能明顯的提高提取率。同時(shí)，由于超聲的空化作用，可以顯著提高葛根素的溶解和擴(kuò)散，有利于成分的溶出，所以反應(yīng)時(shí)間更短，所需的反應(yīng)溫度、乙醇濃度也更低。

3　總結(jié)

采用乙醇回流法提取葛根素的最佳工藝條件為：乙醇濃度75%，提取溫度90℃，提取時(shí)間90 min，固液比為1∶20（g/mL），葛根素的提取率為86.20%。而超聲波輔助法提取葛根素的最佳工藝條件為：乙醇濃度60%，提取溫度80℃，固液比為1∶20（g/mL），提取時(shí)間50 min，葛根素的提取率為95.85%。超聲波輔助法的提取率明顯高于乙醇回流法，并且所需乙醇濃度更低、反應(yīng)時(shí)間更短，有利于工藝的推廣應(yīng)用。

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Extracting Puerarin with Ultrasonic Assisted and Alcohol Refluxing Method

WANG Zhen-wei，HU Xiao-bing，CHEN Xi-liang
（Applied Chemistry Research Center，Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475004，Henan，China）

Abstract：Active ingredients puerarin was extracted from pueraria via ultrasound method and reflux method，respectively. Effects of reaction time，reaction temperature，solid-liquid ratio，ethanol concentration on the extraction rate were investigated. And then optimized process was designed through orthogonal design. The results demonstrated that the optimum conditions by ethanol extraction was ethanol concentration 75%，extraction temperature 90℃，extraction time 90 min，solid-iquid of 1∶20（g/mL）. The resulting extracting rate of puer arin was 86.20%. The optimum conditions of ultrasonic assisted extraction method was ethanol concentration 60%，extraction temperature 80℃，solid-liquid ratio of 1∶20（g/mL），extraction time 50 min. The puerarin extraction rate was up to 95.85%. The extraction rate by ultrasonic way was significantly higher than the way of ethanol refluxing.

Key words：puerarin；ultrasonic wave；refluxing

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.011

基金項(xiàng)目：河南省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（14B550010）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目（14B150008）；黃河水院科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（2013KXJS009）

作者簡介：王振偉（1980—），男（漢），講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物提取與開發(fā)。

收稿日期：2015-03-25