葡萄酒發(fā)酵過程中常見風(fēng)味物質(zhì)含量變化的研究

周艷萍，趙曉寧，段金婷，王煥香，商華，羅飛，朱光華，傅曉方，高大威*（. 燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，河北秦皇島　066004；. 中國長城葡萄釀酒有限公司，河北懷來　075499）

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葡萄酒發(fā)酵過程中常見風(fēng)味物質(zhì)含量變化的研究

周艷萍1，趙曉寧2，段金婷1，王煥香2，商華2，羅飛2，朱光華2，傅曉方2，高大威1*
（1. 燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，河北秦皇島066004；2. 中國長城葡萄釀酒有限公司，河北懷來075499）

摘要：葡萄酒由于其營養(yǎng)價(jià)值以及對健康的有益效果越來越受到人們的關(guān)注。葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)是葡萄酒質(zhì)量的重要決定因素，也是葡萄酒香氣特征的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究分別利用滴定法、高效液相色譜法等，對葡萄酒不同發(fā)酵時(shí)期的幾種風(fēng)味物質(zhì)包括單寧、蘋果酸、乳酸和白藜蘆醇等化學(xué)成分的含量進(jìn)行測定，并分析其在葡萄酒發(fā)酵過程中含量的變化規(guī)律，從而為人工影響葡萄酒的品質(zhì)提供科學(xué)的數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：葡萄酒；風(fēng)味物質(zhì)；單寧；蘋果酸；乳酸；白藜蘆醇

隨著人們生活品質(zhì)的提高，葡萄酒越來越受到大眾的追捧。鑒賞葡萄酒，一般需觀其色、聞其香、品其味，好的葡萄酒色澤清澈自然，香氣純正優(yōu)雅，飲用后令人神清氣爽。葡萄酒是一種美好的風(fēng)味食品，這種風(fēng)味是葡萄酒中的成分和飲酒人的感覺相互作用產(chǎn)生的。研究人員已從葡萄酒中鑒別出1000多種風(fēng)味化合物，這些化合物除源于葡萄果實(shí)外，絕大部分是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，它涵蓋了不同類別的有機(jī)化合物，如烴類、醇類、萜烯醇類、酯類、醛類、酮類、酸類、含硫化合物等。風(fēng)味物質(zhì)在葡萄酒中的含量及其組成決定著葡萄酒的特性，因此，研究葡萄酒中的風(fēng)味物質(zhì)對于改善和提升葡萄酒的風(fēng)味，使其更適應(yīng)我國人民大眾的口味，是葡萄酒生產(chǎn)和銷售中不容忽視的重要環(huán)節(jié)。

目前，關(guān)于葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)成分的檢測已見報(bào)道［1-3］，而有關(guān)風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵過程中含量變化的研究還比較少。本文分別采用滴定法和高效液相色譜法檢測影響葡萄酒風(fēng)味的物質(zhì)，包括單寧、蘋果酸、乳酸和白藜蘆醇，并分析發(fā)酵過程中物質(zhì)的變化，得出最佳發(fā)酵條件，為人工影響葡萄酒品質(zhì)提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1葡萄酒樣品來源

本研究所采用的葡萄酒樣品為赤霞珠葡萄酒，均來自中國長城葡萄酒有限公司沙城產(chǎn)區(qū)，在葡萄酒釀造期間每隔一天采樣一次，直至發(fā)酵結(jié)束。

1.2主要試劑和儀器

磷酸、靛紅、濃硫酸購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈、甲醇（色譜純）購于中國藥品生物制品檢定所；苯酚、高錳酸鉀購于天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；磷酸二氫鉀購于天津泰興試劑廠；Agilent 1100 Series型高效液相色譜儀購自美國安捷倫公司。

1.3單寧的測定

采用高錳酸鉀滴定法來測定單寧含量［4-6］。樣品加水后可以浸提出單寧，因單寧為強(qiáng)還原劑，極易被氧化，采用高錳酸鉀進(jìn)行滴定，以靛紅為指示劑。靛紅被KMnO4氧化后，由藍(lán)色最終變?yōu)榱咙S色，從而可以指示滴定終點(diǎn)。計(jì)算公式如下：

式中：

M表示KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度（moL/L）；

V1表示葡萄酒樣滴定消耗的KMnO4溶液的量（mL）；

V2表示空白樣滴定消耗的KMnO4溶液的量（mL）；

B表示樣品提取液定容總體積（mL）；

b表示測定時(shí)取樣液的體積（mL）；

W表示樣品的重量（g）；

0.0416表示1 mmol KMnO4溶液氧化的單寧克數(shù)。

1.4蘋果酸、乳酸的測定

采用高效液相色譜法來測定蘋果酸、乳酸含量［7-8］。

標(biāo)準(zhǔn)使用液配制：用雙蒸水將蘋果酸、乳酸混合酸的標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度為0.025 g/L、0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

色譜柱：ZORBAX XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：214 nm；流動相：5%甲醇和95%用雙蒸水配的0.1%的磷酸；流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；壓力：93 bar；進(jìn)樣量：20 μL。

將不同濃度的蘋果酸、乳酸混合酸的標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)樣，進(jìn)行定量測定。根據(jù)蘋果酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5白藜蘆醇的測定

白藜蘆醇含量的測定方法為高效液相色譜法（HPLC）［9-11］。

配置9個(gè)不同濃度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)液，其濃度分別為0.1 g/L、0.05 g/L、0.025 g/L、0.0125 g/L、0.00625 g/L、0.003125 g/L、0.0015626 g/L、0.00078125 g/L、0.00039062 g/L。將9個(gè)不同濃度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)液分別裝到100 mL的磨口三角瓶中，放到冰箱中備用。

色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：306 nm；流動相：32%乙腈和68%雙蒸水；流速：1 mL/min；柱溫：室溫；壓力：200 bar；進(jìn)樣量：20 μL。

將不同濃度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)液相色譜儀測試，繪制峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算白藜蘆醇的含量。

圖1　在發(fā)酵周期中葡萄酒樣中單寧含量的變化

2　結(jié)果與分析

2.1各個(gè)發(fā)酵時(shí)期酒樣單寧含量的變化趨勢分析

由實(shí)驗(yàn)方法可知，其中M=0.01 mol/L，B=10 mL，b=2.5 mL，通過測定及公式計(jì)算出的單寧各時(shí)期的百分含量，繪制變化趨勢圖。由圖1可以看出，單寧含量首先呈降低趨勢，由于單寧主要存在于葡萄的果梗、果皮中，推測開始時(shí)混入了一定量的葡萄枝梗，單寧直接融入酒液中，隨著葡萄梗被篩出去，單寧含量稍有降低。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，一部分來源于葡萄的單寧（內(nèi)源單寧），在葡萄酒發(fā)酵的過程中從葡萄果皮和籽中浸提出來，所以在發(fā)酵第9天，呈上升趨勢。之后內(nèi)源單寧雖在發(fā)酵過程中繼續(xù)浸提出來，但同時(shí)單寧也與其他物質(zhì)反應(yīng)而被消耗，如單寧與水溶性蛋白和非水溶性蛋白的反應(yīng)、與金屬離子的絡(luò)合作用，以及在酶、水、空氣、堿性等條件下的氧化。單寧的消耗速度大于從葡萄中浸漬速度，便呈現(xiàn)了逐漸下降趨勢。除釀酒工藝的影響外，帶皮發(fā)酵能夠促使更多的單寧進(jìn)入葡萄酒中，與此同時(shí)，單寧與酒液中其他物質(zhì)的相互反應(yīng)沒有之前那么激烈，速度相對減緩，當(dāng)單寧消耗速度小于其浸出速度時(shí)，單寧的百分含量第二次升高，直到逐漸穩(wěn)定達(dá)到平臺期。

2.2蘋果酸、乳酸測定結(jié)果及其分析

將蘋果酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)樣，得到蘋果酸、乳酸的保留時(shí)間分別為4.0 min、4.8 min左右（圖2）。分別以其濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制蘋果酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Origin7.0軟件進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程分別為：y=2.74126+638.80178x（R2=0.9997）；y=0.13835+644.89463x（R2=0.9998）。

從圖3可見，葡萄酒在發(fā)酵過程中蘋果酸的含量呈下降趨勢，而乳酸呈上升趨勢。葡萄酒中的蘋果酸來源于葡萄，前段的下降主要是由于在酒精發(fā)酵的過程中被酵解。從發(fā)酵第11天至發(fā)酵第25天這一段平臺期可能是由于酵母菌分解蘋果酸已經(jīng)達(dá)到閾值，蘋果酸濃度不再下降。后一段時(shí)間蘋果酸含量下降后達(dá)到平臺期，主要是由于葡萄酒進(jìn)入蘋果酸-乳酸發(fā)酵后，乳酸菌分解蘋果酸而產(chǎn)生乳酸而導(dǎo)致的。綜上：蘋果酸在發(fā)酵過程中含量的降低一部分是由于酵解，另一部分是由于乳酸菌的分解而減少；葡萄酒中的乳酸并不是來源于葡萄，而是發(fā)酵的產(chǎn)物；葡萄酒在發(fā)酵過程中乳酸含量變化趨勢線中前段的上升主要是由于前發(fā)酵的過程中酵母代謝產(chǎn)生少量的乳酸，后一段時(shí)間乳酸含量上升主要是由于進(jìn)入蘋果酸-乳酸發(fā)酵后，乳酸菌分解蘋果酸而產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致的。

由圖3可知，蘋果酸乳酸總量并不完全符合化學(xué)計(jì)量關(guān)系，也有一定的變化趨勢。前發(fā)酵過程中呈先緩慢下降后上升的趨勢，直到第17天與開始含量相差不多，在后發(fā)酵過程中，又一次呈先下降后上升的趨勢直到平穩(wěn)?？偟膩碚f，蘋果酸乳酸總量減少主要是蘋果酸通過酶的作用或其它代謝途徑產(chǎn)生乳酸以外的其他物質(zhì)。蘋果酸乳酸總量的增加主要是由于發(fā)酵過程中其它代謝途徑或化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生乳酸。通常，多數(shù)干型葡萄酒都含有一定濃度的殘?zhí)?，主要有己糖（果糖和葡萄糖）及少量戊糖（木糖、核糖和阿拉伯糖），這些糖均能被蘋果酸-乳酸菌所代謝，研究較多的是己糖的發(fā)酵，乳酸菌能夠利用6-磷酸果糖途徑和磷酸戊糖途徑分解己糖，生成乳酸、酒精、乙酸及CO2等產(chǎn)物，乳酸含量增加，使蘋果酸和乳酸總量增加［12］。

圖2　蘋果酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖3　發(fā)酵過程中蘋果酸、乳酸及總酸的變化趨勢

2.3白藜蘆醇測定結(jié)果及其分析

在上述的最佳色譜條件下得到白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖見圖4，白藜蘆醇的保留時(shí)間在4.7 min左右。以白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，以白藜蘆醇峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Origin 7.0軟件進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程y=101555x-4.3934（R2=0.9997），相關(guān)性較高。

由圖5可知，從發(fā)酵開始，白藜蘆醇含量逐漸緩慢上升，直至發(fā)酵第5天達(dá)到最大值。主要是由于葡萄酒中的白藜蘆醇來源于葡萄，當(dāng)葡萄除梗并且破碎成汁的時(shí)侯，白藜蘆醇（苷）及其衍生物均存在于葡萄皮和葡萄籽中，其存在形式為與β-葡萄糖苷、花青素及單寧等結(jié)合生成的非黃酮類多酚化合物，并沒有游離進(jìn)入到葡萄汁中，所以發(fā)酵初期葡萄汁中白藜蘆醇含量相對較少。由于果膠酶（葡聚糖酶）的添加和酵母發(fā)酵的進(jìn)行，在酶解作用下使葡萄皮中的白藜蘆醇（苷）以及其衍生物單體釋放出來，之后被發(fā)酵所產(chǎn)生的酒精反復(fù)萃取進(jìn)入葡萄酒中，因此，隨著酒精量的增加，白藜蘆醇的含量也有所增加。當(dāng)葡萄皮、籽中的白藜蘆醇完全萃取進(jìn)入到葡萄酒中并形成單體時(shí)，白藜蘆醇的來源被切斷，所以葡萄酒中白藜蘆醇在發(fā)酵第5天到第19天以其最大值時(shí)保持一定的時(shí)間。發(fā)酵19天后，酒精發(fā)酵完成，除去皮渣進(jìn)入蘋乳發(fā)酵，輕度氧化作用使白藜蘆醇及其衍生物含量稍有下降并維持在一定水平。白藜蘆醇在葡萄酒發(fā)酵過程中整體上存在流失現(xiàn)象，但是發(fā)酵過程也會產(chǎn)生微量的白藜蘆醇。

圖4　白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖5　葡萄酒在發(fā)酵過程中白藜蘆醇的變化趨勢

3　結(jié)論

葡萄酒中的酸類、糖類、酚類等物質(zhì)對葡萄酒風(fēng)味起到重要作用。隨著科技的發(fā)展，葡萄酒風(fēng)味的分析手段越來越精確。本研究中分別采用滴定法和高效液相色譜法測定了干紅葡萄酒中的單寧、蘋果酸、乳酸和白藜蘆醇在葡萄酒不同發(fā)酵時(shí)期的含量變化，單寧含量呈先增大后減小再增大的趨勢，蘋果酸總體呈下降趨勢，乳酸總體呈上升趨勢，總酸含量變化不大，白藜蘆醇含量先增大后減小，然后保持平穩(wěn)。根據(jù)各物質(zhì)在各發(fā)酵時(shí)期的含量變化趨勢，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，可以把理化分析數(shù)據(jù)和感官特性結(jié)合起來，相輔相成，為改進(jìn)和提高葡萄酒工藝，提高葡萄酒質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

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并列第一作者：趙曉寧（1988-），女，碩士學(xué)位，從事葡萄酒釀造工作。E-mail： zhaoxiaoning2013@sina.com

Changes of the common flavour of grape wine in fermentation process

ZHOU Yanping1, ZHAO Xiaoning2, DUAN Jinting1, WANG Huanxiang2, SHANG Hua2, LUO Fei2, ZHU Guanghua2, FU Xiaofang2, GAO Dawei1*
（1. College of Environmental and Chemical Engineering, Yanshan University, Qin Huangdao, Hebei, 066004；2. China Greatwall Wine Co., Ltd, Huailai, Hebei, 075499）

Abstract：Grape wine has drawn more and more attention currently for its nutrition and healthy function. Grape Wine flavour is an important determinant of wine quality, and it is also the material basis of wine aroma characteristics. The contents of four kinds of chemical compositions （tannin, malic acid, lactic acid, resveratrol） in wine were determined during different fermentation periods by different test methods, and the trends were analyzed to obtain the variational rule during the brewing process, to provide scientific data for the quality of wine.

Key words：wine； flavor substance； tannin； malic acid； lactic acid； resveratrol

中圖分類號：TS262.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2016.03.005

收稿日期：2016-03-14

項(xiàng)目基金：秦皇島市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃（基金號：201402B029）

作者簡介：周艷萍（1980-），女，碩士學(xué)位，主要從事生物化學(xué)和分析化學(xué)的研究工作。

*通訊作者：高大威（1970-），女，教授，主要從事微生物發(fā)酵和納米生物學(xué)研究。E-mail： dwgao@ysu.edu.cn