硫酸鹽還原菌的馴化及硫酸鹽降解動(dòng)力學(xué)研究

段　黎， 皮科武

(湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 湖北 武漢 430068)

硫酸鹽還原菌的馴化及硫酸鹽降解動(dòng)力學(xué)研究

段黎， 皮科武

(湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 湖北 武漢 430068)

[摘要]為了有效處理酸性礦山廢水(Acid Mineral Drainage, AMD)，獲得耐低pH的硫酸鹽還原菌(Sulphate Reducing Bacteria, SRB)，先在pH為7的條件下用Postgate's C培養(yǎng)基對(duì)SRB進(jìn)行富集培養(yǎng)，然后逐步降低培養(yǎng)基中的pH值，依次在pH為6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的Postgate's C培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)SRB，對(duì)馴化過(guò)程中溶液的pH和硫酸鹽濃度進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)硫酸鹽的降解過(guò)程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)擬合。結(jié)果表明，經(jīng)馴化后SRB可以在pH為4的環(huán)境中生長(zhǎng)，馴化傳代后的SRB在pH為4的條件下pH上升到5.0左右，硫酸鹽的去除率達(dá)到38%，馴化效果比較明顯。硫酸鹽的降解速度模型符合指數(shù)速度模型，且培養(yǎng)基中起始pH越低，降解速率越慢。

[關(guān)鍵詞]硫酸鹽還原菌；馴化；硫酸鹽；降解動(dòng)力學(xué)

AMD是一類低pH、含高濃度硫酸鹽和可溶性重金屬離子的廢水，如果不經(jīng)處理直接排入水體中，會(huì)使受納水體酸化，對(duì)河流中的水生生物造成極大的危害；另外，重金屬離子由于無(wú)法被降解，一旦進(jìn)入環(huán)境中后就會(huì)不斷累積而難以去除，還會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)，造成環(huán)境的長(zhǎng)期污染。因此，有效治理酸性礦山廢水是一個(gè)亟待解決的重大問(wèn)題[1]。

用SRB處理AMD可以還原硫酸根，提高廢水pH及去除重金屬[2-3]。SRB處理酸性廢水的作用機(jī)理為：通過(guò)還原硫酸鹽，產(chǎn)生硫化物，同時(shí)在硫酸鹽降解的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生堿度，從而會(huì)讓酸性廢水中pH上升；另外廢水中的金屬離子與反應(yīng)生成的S2-結(jié)合產(chǎn)生沉淀，由此降低廢水中金屬離子的濃度。

SRB利用有機(jī)物將SO42+還原，提高pH，去除金屬離子的過(guò)程可表示為：

(1)

(2)

(3)

其中，CH2指能提供電子的各種有機(jī)碳源物，如葡萄糖、氨基酸等；M2+指容易與硫化物產(chǎn)生沉淀的金屬陽(yáng)離子，如Cu2+、Fe3+、Mn4+等[4-6]。本實(shí)驗(yàn)以SRB法處理AMD為背景，在不同pH條件下對(duì)SRB進(jìn)行逐步馴化，以得到耐酸性的SRB，并對(duì)馴化過(guò)程中硫酸鹽濃度的變化進(jìn)行曲線擬合，對(duì)降解過(guò)程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。

1材料與方法

1.1菌種來(lái)源

硫酸鹽還原菌菌種由武漢理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2培養(yǎng)基

采用Postgate's C培養(yǎng)基，培養(yǎng)基各成分的質(zhì)量濃度為：KH2PO4，0.5 g/L；CaSO4，l.0 g/L；NH4Cl 1.0 g/L；FeSO4·7H2O，0.01 g/L；Na2SO4，4.5 g/L；CaCl2·6H2O，0.06 g/L；MgSO4·7H2O，0.06g/L；檸檬酸鈉，0.3 g/L；乳酸鈉，3.5 g/L；酵母浸膏，1.0 g/L。20%NaOH調(diào)pH值[7]。

1.3pH的測(cè)定

在培養(yǎng)馴化的過(guò)程中每天用注射器在厭氧培養(yǎng)瓶中取樣，測(cè)定pH值的變化。

1.4SO42+濃度的測(cè)定

采用鉻酸鋇分光光度法[8]。在酸性溶液中，鉻酸鋇與硫酸鹽生成硫酸鋇沉淀，并釋放出鉻酸根離子。反應(yīng)后溶液中剩余的鉻酸鋇和生成的硫酸鋇沉淀可通過(guò)過(guò)濾除去。鉻酸根離子在堿性條件下呈現(xiàn)黃色，測(cè)定其吸光度可知硫酸鹽的含量。用注射器在厭氧培養(yǎng)瓶中取20 mL水樣于錐形瓶中，向其中加入l mL 2.5 mol/L鹽酸溶液，加熱煮沸5 min 左右；取下后再加2.5 mL鉻酸鋇懸濁液，再煮沸5 min 左右；稍冷后，逐滴加入(1+1)氨水至溶液呈檸檬黃色，再多加2 滴，待溶液完全冷卻后過(guò)濾，用50 mL比色管收集濾液，然后用蒸餾水稀釋到刻度線。在420 nm 波長(zhǎng)下，用10 mm比色皿，測(cè)定吸光度。用同樣方法以硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算硫酸根含量。

1.5實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

722N可見分光光度計(jì), 上海光譜儀器有限公司；電子天平, 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PHS-3C pH計(jì), 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SKY-2102恒溫?fù)u床, 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；SHZ-DIII真空抽濾裝置, 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DL-1電子萬(wàn)用電爐, 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

2實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

2.1SRB富集培養(yǎng)

用250 mL的厭氧培養(yǎng)瓶，Postgate's C培養(yǎng)基配置好，調(diào)節(jié)pH至7后，轉(zhuǎn)入?yún)捬跖囵B(yǎng)瓶中，用高純的氮?dú)馀叛?5 min，在35℃搖床中預(yù)熱1 h，將采集的厭氧泥水混合物以10%的接種比例轉(zhuǎn)入其中，再次用N2排氧15 min，最后將厭氧瓶在35℃轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床中暗室培養(yǎng)10 d左右至培養(yǎng)基顏色變黑，且用醋酸鉛試紙條置于瓶口測(cè)試，試紙變黑，說(shuō)明此時(shí)已獲得了富集菌液。在培養(yǎng)過(guò)程中每天用注射器在厭氧瓶中取20 mL液體測(cè)定其pH值和SO42+質(zhì)量濃度。圖1是pH和SO42+質(zhì)量濃度的變化情況。

(a)pH變化

(b)SO42+質(zhì)量濃度變化圖 1　在pH為7的條件下培養(yǎng)時(shí)pH和SO42+質(zhì)量濃度

從圖1可看出SRB在最適pH條件下生長(zhǎng)時(shí)，從開始培養(yǎng)到第8天左右pH保持穩(wěn)定持續(xù)上次，從起始值7.0上升到8.0左右，培養(yǎng)液中SO42+的起始濃度是1600 mg/L，培養(yǎng)到第8天時(shí)，SO42+濃度降低到200 mg/L，SO42+的去除率達(dá)到88%。第9天、第10天pH和SO42+濃度幾乎沒變化，可能是厭氧培養(yǎng)瓶中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，SRB的活性降低。

2.2SRB馴化培養(yǎng)

以Postgate's C培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)，逐步降低pH馴化SRB，用20%H2SO4調(diào)菌液pH，使pH降低，觀察菌的生長(zhǎng)情況，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變黑，且用醋酸鉛試紙條置于瓶口測(cè)試，試紙變黑時(shí)，轉(zhuǎn)入pH更低的培養(yǎng)基中，以此培養(yǎng)方法最終獲得能耐受低pH的SRB，依次在pH=6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的培養(yǎng)基以10%的接種比例轉(zhuǎn)入其中，在35℃轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床中暗室培養(yǎng)。根據(jù)富集培養(yǎng)過(guò)程中pH和SO42+濃度的變化情況，8 d以后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，因此每個(gè)批次培養(yǎng)8 d，在培養(yǎng)過(guò)程中每天用注射器在厭氧瓶中取20 mL液體測(cè)定其pH值和SO42+濃度。圖2是馴化過(guò)程中不同起始條件下pH的變化情況。

圖 2　不同起始pH條件下pH的變化

由圖2可知，起始pH為6.5 、6的培養(yǎng)液中，8 d后溶液中pH均上升到8左右，pH為5.5、5.0分別上升到7和6，而pH為4.5的培養(yǎng)液中pH上升到5.0，pH為4.0的培養(yǎng)液中pH上升到4.3，說(shuō)明pH為4的培養(yǎng)液中SRB生長(zhǎng)速率慢，代謝不旺盛，這是因?yàn)檫^(guò)酸的環(huán)境均對(duì)SRB的生長(zhǎng)有顯著抑制作用。

(a)pH=6.5時(shí)

(b)pH=6.0時(shí)

(c)pH=5.5時(shí)

(d)pH=6.0時(shí)

(e)pH=4.5時(shí)

(f)pH=4.0時(shí)圖 3　不同起始pH條件下SO42+的變化及去除率

圖3是不同起始pH條件下SO42+的變化及去除率，可見pH=6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0的條件下培養(yǎng)8 d之后SO42+的去除率分別為73.7%、66.8%、54.5%、48.1%、26.1%、15.4%，說(shuō)明pH值越低越不利于硫酸鹽的降解。

2.3SBR馴化后的傳代培養(yǎng)

在250 mL的厭氧培養(yǎng)瓶，Postgate's C培養(yǎng)基配置好后，調(diào)節(jié)pH至4后，以10%的接種比例將馴化至pH為4的菌液轉(zhuǎn)入其中，在35℃轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床中暗室進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中每天用注射器在厭氧瓶中取20 mL液體測(cè)定其pH值和SO42+質(zhì)量濃度。圖4是pH和SO42+濃度的變化。由圖4可知傳代后pH值8 d后上升到5.0左右，SO42+的去除率為38%，比pH為4馴化第一代硫酸鹽降解效果明顯。

(a)pH變化

(b)SO42+質(zhì)量濃度變化圖 4　pH為4的SRB傳代后pH和SO42+的變化及去除率

圖5是馴化前后SO42+去除率的比較，可知未經(jīng)馴化的SRB在pH為4的條件下培養(yǎng)時(shí)SO42+去除率為0.9%，硫酸鹽幾乎沒有降解，這是因?yàn)檫^(guò)酸的環(huán)境不利于SRB的生長(zhǎng)，對(duì)微生物的代謝有抑制作用。而馴化初期，第一代馴化的耐酸性SRB的SO42+去除率最后達(dá)到15%，由此傳代后SRB的SO42+去除率達(dá)到38%，說(shuō)明馴化達(dá)到了比較明顯的效果。

圖 5　馴化前后SO42+去除率的比較

3硫酸鹽降解的動(dòng)力學(xué)分析

為了進(jìn)一步了解在SRB的作用下硫酸鹽降解的過(guò)程，對(duì)硫酸鹽降解速率進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行曲線擬合，將實(shí)際降解時(shí)間t(d)作為自變量x，SO42+質(zhì)量濃度(mg/L)作為因變量y，擬合結(jié)果如圖6所示。

圖 6　SO42+質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化曲線

硫酸鹽降解的關(guān)系式為

SO42+= A0+ A1t+ A2t2+A3t3+ A4t4

各參數(shù)和相關(guān)系數(shù)如表1所示。

假設(shè)硫酸鹽的降解速度模型符合指數(shù)速度模型[9]，指數(shù)速度的數(shù)學(xué)模型為

(1)

式中：v為降解速度；K為速度常數(shù)，它表示單位濃度的反應(yīng)速度，又稱反應(yīng)比速；n為反應(yīng)級(jí)數(shù)；c為SO42+質(zhì)量濃度,mg/L；t為硫酸鹽降解時(shí)間,d。

對(duì)式(1)兩邊取對(duì)數(shù)得

lgV=lgK+nlgc

(2)

由lgc對(duì)lgV進(jìn)行一元線性回歸，通過(guò)計(jì)算SO42+降解過(guò)程的速度，并對(duì)其速度和濃度求對(duì)數(shù)，再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，求取降解過(guò)程中反應(yīng)級(jí)數(shù)n和速率常數(shù)K的曲線(圖7)。

表1　SO42+濃度變化參數(shù)

(a)pH=7.0時(shí)

(b)pH=6.5時(shí)

(c)pH=6.0時(shí)

(d)pH=5.5時(shí)

(e)pH=5.0時(shí)

(f)pH=4.5時(shí)

(g)pH=4.0時(shí)圖 7　不同起始pH條件下SO42+降解動(dòng)力學(xué)擬合曲線

表2說(shuō)明硫酸鹽的降解速度模型符合指數(shù)速度模型，且起始pH越低，K值越小，表示降解速度越慢。因?yàn)榱蛩猁}的降解是SRB的作用，而微生物的生長(zhǎng)代謝受pH的影響很大，pH越低，越不利于SRB的生長(zhǎng)，進(jìn)而不利于硫酸鹽的降解。

表2　不同起始pH條件下SO42+降解動(dòng)力學(xué)擬合參數(shù)

表2中的各項(xiàng)相關(guān)系數(shù)R2均大于0.97，說(shuō)明擬合度高。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用Postgate's C培養(yǎng)基，在35℃厭氧的環(huán)境下，通過(guò)逐步降低培養(yǎng)基中pH值對(duì)SRB分批馴化培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)液中的pH和硫酸鹽濃度變化情況進(jìn)行分析比較，并對(duì)硫酸鹽降解的過(guò)程進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)研究。研究結(jié)果表明，經(jīng)馴化后，SRB能在pH為4的條件下生長(zhǎng)，硫酸鹽的去除率能達(dá)到15%，傳代后硫酸鹽的去除率能達(dá)到38%，而沒有經(jīng)過(guò)馴化的SRB在pH為4的條件下幾乎不能生長(zhǎng)，硫酸鹽去除率僅為0.9%，說(shuō)明馴化過(guò)程對(duì)SRB的耐低pH生長(zhǎng)能力有顯著效果。

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[責(zé)任編校： 張眾]

Study on the Domestication of Sulphate Reducing Bacteria and the Kinetics of Sulphate Degradation

DUAN Li, PI Kewu

(1SchoolofResourcesandEnvironmentalEngin.,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Abstract：In order to obtain the Sulphate reducing bacteria which can grow under the condition of low pH to deal with low pH acid mine waste water effectively, the SRB was first enriched and cultured on the Postgate's C medium at pH 7. Then the pH value of the medium was gradually reduced, and the SRB was respectively acclimated and cultured on Postgate's C medium at pH 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4. In the process of domestication, the pH and sulphate concentration were determined, and the kinetics of the degradation of sulphate concentration was fitted. The results showed that the SRB can grow in the environment of pH 4. After domestication, the pH increased to about 5 under the condition of pH 4, and the removal rate of sulphate reached 38%, and the effect of domestication was obvious. The degradation rate of the sulphate was in accord with the exponential velocity model. The lower the initial Ph is, the slower the degradation rate is.

Keywords：SRB; domestication; sulphate; degradation kinetics

[收稿日期]2016-01-15

[作者簡(jiǎn)介]段黎(1991-)， 女，湖北天門人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)樗嵝缘V山廢水處理技術(shù)與設(shè)備

[文章編號(hào)]1003-4684(2016)02-0116-05

[中圖分類號(hào)]X522

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]：A