有機(jī)肥料對(duì)土壤微生物多樣性影響研究進(jìn)展

王靖淵　屠乃美　何康　侯方舟　付小紅　楊旭初

摘 要：主要介紹了傳統(tǒng)法、BIOLOG法、磷脂脂肪酸（PLFA）法、PCR分析法進(jìn)行土壤微生物多樣性分析的優(yōu)缺點(diǎn)，闡述了有機(jī)肥概念，綜述了有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性的影響。指出施用有機(jī)肥對(duì)微生物多樣性的不同影響， 合理配施有機(jī)肥對(duì)于土壤微生物數(shù)量、結(jié)構(gòu)和組成都有影響，有助于降低作物發(fā)病率，同時(shí)能夠有效提高作物產(chǎn)量和產(chǎn)值。文章還針對(duì)當(dāng)前研究的方法和探索的方向進(jìn)行了歸納和總結(jié)，對(duì)今后有機(jī)肥關(guān)于微生物的研究方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：有機(jī)肥；微生物；多樣性

中圖分類號(hào)：S143.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.06.012

Effect of Organic Fertilizer on Soil Microbial Diversity Progress

WANG Jingyuan1，2， TU Naimei2， HE Kang1，2， HOU Fangzhou1，2， FU Xiaohong1，2， YANG Xuchu1，2

（1.College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China； 2.Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Multi-cropping Cultivation and Farming System， Changsha， Hunan 410128， China）

Abstract： This paper described the advantages and disadvantages of several soil microbial diversity analysis methods conducted by conventional methods， BIOLOG law， PLFA and PCR. Described the influences of organic fertilizeron soil microbial diversity. And pointed out the effect of organic fertilizer application on the microbial diversity soil microorganisms， reduced the incidence of crops and improve crop yields. Problems of current researches and future research directions were suggested.

Key words： organic fertilizer； microorganisms； diversity

土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)的動(dòng)力，是土壤具有生命力的標(biāo)志性特征，與土壤健康和肥力有著密切關(guān)系，對(duì)周圍環(huán)境的變化做出迅速反應(yīng)，在土壤不斷的形成、發(fā)育、能量傳遞和物質(zhì)轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著非常重要的作用，是目前評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，對(duì)自然元素循環(huán)具有重要意義[1]。隨著近年來，人口的急速增加、自然環(huán)境和資源的過度開發(fā)使用、環(huán)境問題的加劇和外來生物物種的入侵，使得土壤微生物多樣性受到了強(qiáng)烈的影響和干擾[2-4]。多層次的深入研究土壤微生物多樣性能有助于了解土壤目前的狀況，并以此為基礎(chǔ)制定生態(tài)環(huán)境保護(hù)、自然資源合理利用的措施。隨著研究技術(shù)的更新和完善，微生物多樣性研究方法和層次都得到了大幅度提升和改善， 有關(guān)土壤微生物多樣性的研究方向和角度愈發(fā)深入[5-6]。本文在前人研究的基礎(chǔ)上重點(diǎn)探討了目前較為常見的幾種土壤微生物多樣性的研究方法，以及施用有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性影響的研究進(jìn)展。

1 土壤微生物多樣性主要分析方法

傳統(tǒng)微生物多樣性的研究分析方法的原理是根據(jù)已知的目標(biāo)微生物特性來選擇合適的培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)，然后通過對(duì)各種微生物在培養(yǎng)期間的生理生化特征和外觀形態(tài)不同的變化進(jìn)行區(qū)分鑒定。利于衡量小型微生物群體的多樣性，其優(yōu)點(diǎn)是簡便快捷。但是由于技術(shù)條件的限定，常導(dǎo)致微生物富集生長，且反映的微生物信息有限，誤差大[7-9]。

BIOLOG系統(tǒng)是研究土壤微生物功能多樣性和群落結(jié)果的方法。所運(yùn)用的原理是接種經(jīng)過稀釋的土壤菌懸液后，根據(jù)土壤中不同的微生物對(duì)單一碳源底物的利用所呈現(xiàn)出的能力差異， 讓氧化反應(yīng)指示四唑類顯色物質(zhì)呈現(xiàn)出不同程度的紫色， 構(gòu)成該微生物的特定指紋。運(yùn)用特有的排列顯型技術(shù)通過配套的BIOLOG軟件進(jìn)行比較分析土壤微生物的代謝特征指紋圖譜，與標(biāo)準(zhǔn)菌種的數(shù)據(jù)庫比較之后反映不同環(huán)境條件引起的土壤微生物群落變化[10]。與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法相比，BIOLOG碳源利用法有固定碳源，無需配置微生物培養(yǎng)基，方便、高效、分辨力強(qiáng)、靈敏度高、易于測定等優(yōu)點(diǎn)，但是由于培養(yǎng)環(huán)境的改變和標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫的不健全，所以存在誤差和有些種類不能鑒定的問題[11]。

PLFA分析法是一種通過磷脂脂肪酸含量和組成，表征土壤微生物在數(shù)量上具有優(yōu)勢的群落，并且可以快速有效的重現(xiàn)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，分析微生物多樣性的方法。其原理是利用死亡的細(xì)胞在降解分離時(shí)所形成的不同磷脂脂肪酸的比例、組成和種類，進(jìn)而判斷微生物種類，確定微生物群落多樣性[12]。相對(duì)于傳統(tǒng)微生物學(xué)方法，PLFA法直接提取原位上所需要測定的土壤微生物群落細(xì)胞中磷脂脂肪酸，避免了傳統(tǒng)微生物學(xué)方法直接通過培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法所引起的實(shí)驗(yàn)誤差，測定土壤微生物的生物量更準(zhǔn)確有效，能精準(zhǔn)快速的處理大量土壤樣品。PLFA圖譜可用于研究微生物的群落結(jié)構(gòu)和微生物代謝條件。PLFA法可測定土壤微生物總量和特殊功能的菌群生物量，比傳統(tǒng)法的檢測范圍更廣。當(dāng)然，該方法在應(yīng)用中也有不足之處：首先，土樣中的生物特征脂肪酸尚未建設(shè)完全；其次PLFA法尚不能在菌種和菌株水平上鑒定出微生物的種類；第三，PLFA的提取過程易受外界水熱光照等因素的干擾；第四，由于不飽和脂肪酸會(huì)與氧氣反應(yīng)發(fā)生自氧化作用而揮發(fā)，導(dǎo)致被分析樣品不易保存[13]。endprint

PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)反應(yīng)類型是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種細(xì)胞在體外通過擴(kuò)增核酸序列從而可以得到多個(gè)核酸的技術(shù)，在分析擴(kuò)增土壤微生物DNA常用這種技術(shù)，并且可以對(duì)土壤微生物DNA進(jìn)行有效的數(shù)據(jù)定量或定性的分析。目前實(shí)驗(yàn)所常采用的PCR分析處理方法主要有：變性梯度凝膠電泳（DGGE）、克隆文庫法、核糖體基因間區(qū)分析（RISA）、限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）、末端限制性片段長度多態(tài)技術(shù)（T-RFLP）和溫度梯度凝膠電泳（TGGE）等。PCR法優(yōu)點(diǎn)：不受環(huán)境的影響和基因是否表達(dá)的限制；無需其他特殊材料，所測得的等位位點(diǎn)變異水平比其表型更為豐富；測得的數(shù)量很大，幾乎遍及所有的基因組；標(biāo)記的多數(shù)分子表現(xiàn)為共顯性，能夠很準(zhǔn)確的分辨幾乎所有的基因型。綜合以上優(yōu)點(diǎn)，PCR法在土壤微生物研究得到廣泛的運(yùn)用。但PCR法多適用于原核生物；實(shí)驗(yàn)條件要求高，技術(shù)分析所需要的成本高、分析費(fèi)時(shí)。在土壤微生物的總DNA提取過程當(dāng)中，由于其他物質(zhì)干擾和DNA不穩(wěn)定，很容易呈假陽性或PCR擴(kuò)增失敗。使得PCR法在微生物定量分析和種類鑒別等方面也存在不足[14-15]。

針對(duì)上述方法所存在的不足和缺陷，許多研究者在前期的實(shí)驗(yàn)操作和后期的數(shù)據(jù)處理時(shí)都做了大量的嘗試和努力。讓數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)更直觀精準(zhǔn)，處理間的差異性更明顯，實(shí)驗(yàn)的成本更低。

席勁瑛等[ 16]通過定義一個(gè)與 Biolog 微孔板相對(duì)應(yīng)的網(wǎng)格圖，使生物群落代謝信息更直觀、快速、有效。譚兆贊等[17]通過利用多種數(shù)學(xué)方法，優(yōu)化了Biolog方法的碳源設(shè)計(jì)，從 31 種碳源中篩選10 種特征碳源，使土壤微生物群落功能特征變化更準(zhǔn)確有效。。Haack等[18]在簡單采用PLFA方法提取磷脂脂肪酸的基礎(chǔ)上，同時(shí)結(jié)合MIDI方法來提取和分析細(xì)胞中的磷脂脂肪酸，最后用開發(fā)商所提供的MIDI自動(dòng)程序軟件進(jìn)行磷脂脂肪酸分析。。樊曉剛等[19]為找出最佳提取DNA方法，對(duì)比采用了手提和試劑盒兩種提取方法，通過檢驗(yàn)這兩種提取方式PCR結(jié)果，最終確定最優(yōu)條件；同時(shí)采用雙梯度凝膠電泳，提高了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，降低了成本。

每種方法涉及的實(shí)驗(yàn)原理不同，所呈現(xiàn)出的精度、范圍和準(zhǔn)確性都會(huì)有所差異，如Oka等[20]在采用 PLFA和BIOLOG兩種方法分別對(duì)一些微生物進(jìn)行識(shí)別時(shí)，發(fā)現(xiàn)這兩種方法具有錯(cuò)誤辨識(shí)。

為了客觀全面的評(píng)價(jià)微生物多樣性，更真實(shí)的反映微生物群落數(shù)量、功能和結(jié)構(gòu)的變化，將多種技術(shù)和方法相結(jié)合成為了一條新的思路。

Bodelier等[21]綜合利用了PCR-DGGE和PLFA兩種方法，分析研究了水稻土壤中的甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)。Ross等[22]采用了核酸和BIOLOG相結(jié)合的方法，對(duì)地下水中的微生物遺傳多樣性和代謝多樣性進(jìn)行了研究。Ibekwe等[23]在研究不同種植條件下，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)：PLFA方法和 BIOLOG方法測得結(jié)果基本一致，但PLFA方法在檢測時(shí)更加靈敏一些。Yao等[24]在研究和評(píng)價(jià)不同肥力與不同耕種歷史的紅壤中微生物群落結(jié)構(gòu)差異時(shí)，總結(jié)出了和Ibekwe相同的結(jié)論。邢華銘等[25]分析比較BIOLOG和PCR-DGGE兩種技術(shù)方法，得出BIOLOG得到的數(shù)據(jù)變化范圍更大，而PCR-DGGE技術(shù)在對(duì)微生物結(jié)構(gòu)和組成方面顯得更敏感，所得信息多，偏差小。Widmer 等[26]對(duì)使用過殺蟲劑的土壤分別用DNA、PLFA、BIOLOG3種方法分別檢測同一實(shí)驗(yàn)處理的土壤微生物，發(fā)現(xiàn)所采用的這三種方法處理間的重復(fù)性都很好，能很好檢測出不同處理與處理間的土壤差異性，但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)不同方法處理的測定結(jié)果相似性有差異。

因此，在實(shí)驗(yàn)實(shí)施前，根據(jù)需要設(shè)計(jì)，在有技術(shù)和條件的情況下對(duì)樣品進(jìn)行多次的實(shí)驗(yàn)，對(duì)不同方法進(jìn)行比較和分析，以求所得數(shù)據(jù)更全面客觀的體現(xiàn)環(huán)境微生物多樣性的變化，從而彌補(bǔ)單一方法分析微生物多樣性所帶來的單一和不足。

2 有機(jī)肥對(duì)微生物的影響

有機(jī)肥料是指以有機(jī)物為主的自然肥料，多是人和動(dòng)物的糞便以及動(dòng)植物殘?bào)w，一般分為農(nóng)家肥、綠肥和腐殖酸肥三類。研究表明，有機(jī)肥能提高土壤中有機(jī)質(zhì)含量，增加農(nóng)作物產(chǎn)量，改善作物的品質(zhì)[27-29]。微生物性狀常被人們認(rèn)為是衡量土壤中分解有機(jī)質(zhì)的重要參數(shù)，微生物直接參與土壤中有機(jī)質(zhì)的分解，對(duì)土壤中的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)、吸收起著至關(guān)重要的作用。微生物數(shù)量不僅推動(dòng)著土壤中營養(yǎng)與養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，同時(shí)還調(diào)控著土壤中物質(zhì)能量流動(dòng)、養(yǎng)分循環(huán)。土壤中有機(jī)物質(zhì)是土壤微生物的營養(yǎng)和能量的源泉，長期施用有機(jī)肥可以提高土壤中微生物數(shù)量、生物活性和功能多樣性[30-31]。土壤微生物數(shù)量、結(jié)構(gòu)和組成的變化在一定程度上影響著土壤質(zhì)量和植物的健康生長。土壤微生物多樣性研究主要從遺傳 、種類和生態(tài)系統(tǒng)3個(gè)層面展開。土壤微生物多樣性是衡量土壤微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，反應(yīng)了土壤生態(tài)和土壤脅迫對(duì)微生物群落的影響[32]。目前研究者關(guān)于有機(jī)肥對(duì)微生物多樣性的研究重點(diǎn)主要側(cè)重在三個(gè)方面。

2.1 傳統(tǒng)有機(jī)肥

傳統(tǒng)有機(jī)肥料是否對(duì)作物的生長，根系的伸長，作物對(duì)營養(yǎng)成分的吸收和微生物的數(shù)量，生物活性產(chǎn)生影響。張曉海等[33]在研究菜籽餅對(duì)煙田和煙地烤煙根際土壤微生物時(shí)發(fā)現(xiàn)，施用菜籽餅肥能增加土壤中細(xì)菌數(shù)量，且隨著施入量的加大而增多。在烤煙生長中后期根際土壤解磷細(xì)菌、解鉀細(xì)菌的數(shù)量增長很大，硝化細(xì)菌的數(shù)量有所提高。郭利等[34]通過比較微生物多樣性指數(shù)H、均勻度E發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥能促進(jìn)烤煙根系的伸長，提高微生物數(shù)量，促進(jìn)作物生長。楊宇虹等[35]對(duì)比研究了腐熟豬糞、腐熟秸桿和菜籽餅對(duì)煙田微生物數(shù)量影響，指出土壤中真菌、細(xì)菌和放線菌的數(shù)值均有提高，但因養(yǎng)分釋放程度不同，對(duì)總量和高峰持續(xù)的時(shí)間均有影響。于樹等[36]與Dick[37]研究表明，施用廄肥和綠肥等有機(jī)肥都有利于維持或增加微生物的數(shù)量和活性，且有機(jī)肥和無機(jī)肥配施效果更明顯。李自剛等人[38]和肖嫩群等人[39]的研究均發(fā)現(xiàn)稻草還田能提高土壤中好氣性微生物的數(shù)量。還田初期能夠提高土壤微生物活性，顯著提高土壤微生物數(shù)量和含量。endprint

2.2 新型有機(jī)肥

根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要，在傳統(tǒng)有機(jī)肥的基礎(chǔ)上加入生物菌類，以提高有機(jī)肥的腐解程度，盡可能的讓有機(jī)肥腐解釋放養(yǎng)分的周期和作物生長周期相一致，從而在改善土壤理化條件的同時(shí)提高作物產(chǎn)質(zhì)量，達(dá)到最大經(jīng)濟(jì)效益。胡可等[40] 利用BILOG ECO板和傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法，對(duì)不同微生物不同碳源底物的研究發(fā)現(xiàn)，生物有機(jī)肥可提高微生物的數(shù)量、活性和對(duì)不同碳源底物的利用率。加強(qiáng)了微生物代謝，活化了原有的微生物種群，提高了土壤微生物多樣性。李北齊等[41]研究生物有機(jī)肥對(duì)玉米根際的真菌、細(xì)菌數(shù)量的影響，結(jié)果表明施用生物有機(jī)肥的處理真菌數(shù)量減少，但能增加根際土壤微生物的數(shù)量。劉劍君等人[42]通過在烤煙移栽時(shí)施入固氮菌 N05 制成的菌肥，同時(shí)配施80%氮肥和全量施氮肥，烤煙固氮菌的平均數(shù)量提高3.6倍，放線菌數(shù)量降低，呈顯著性差異。除 Mg 元素有效性有所降低外，其他主要礦質(zhì)元素有效性均有所增加。

2.3 將有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性的變化規(guī)律與作物的發(fā)病率結(jié)合起來

通過對(duì)土壤微生物的種類、數(shù)量變化動(dòng)態(tài)和生物學(xué)特性的研究，了解作物發(fā)病的機(jī)理，改善和降低作物的發(fā)病率，提高作物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。Yoshiko等[43]通過根際微生物對(duì)BIOLOG板固定碳源利用率的研究發(fā)現(xiàn)，番茄青枯病菌在一定程度上與土壤根際微生物存在一定的碳源競爭，土壤根際微生物在一定程度上能夠有效抑制青枯病菌的生長。據(jù)徐華勤等[44]和孔維棟等[45]研究結(jié)果表明，施用有機(jī)肥能夠調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和活性，在一定程度上降低土壤中微生物群落的均勻度，通過改良土壤環(huán)境來抑制青枯病。這可能是土壤中含有的有機(jī)質(zhì)量增高，使得土壤中根際微生物的種群優(yōu)勢明顯，導(dǎo)致劣勢種群競爭性進(jìn)一步減弱，從而有可能導(dǎo)致了劣勢種群的逐漸消失，最終結(jié)果是使原有土壤中微生物多樣性有所降低[46]。

3 展 望

隨著人們對(duì)有機(jī)肥對(duì)微生物多樣性影響的研究不斷深入 ，今后的研究工作將主要集中在以下幾個(gè)方面。

3.1 研究方法的選取

根據(jù)不同方法的原理、范圍、精度，通過對(duì)試驗(yàn)的進(jìn)一步對(duì)比和深入研究，找出合適的試驗(yàn)方法。在分析有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性的影響時(shí)，使用一種方法所得到的數(shù)據(jù)具有局限性，在實(shí)際操作運(yùn)用中，可以嘗試兩種或兩種以上的方法，進(jìn)行多維度，多水平上的測試，使得所得數(shù)據(jù)更全面、具體、精確。另外，在對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析的時(shí)候，采用多元統(tǒng)計(jì)方法或者專門的分析軟件。

3.2 研究方向的改進(jìn)

目前的主要研究方向主要停留在有機(jī)肥料是否對(duì)土壤微生物多樣性有影響，以及微生物數(shù)量的變化（主要是細(xì)菌、真菌、放線菌），卻對(duì)有機(jī)肥如何作用土壤微生物的機(jī)理研究甚少。目前研究的重點(diǎn)在有機(jī)肥對(duì)微生物的物種多樣性和生態(tài)多樣性，而缺乏對(duì)生理多樣性和遺傳多樣性研究。有機(jī)肥短時(shí)間內(nèi)對(duì)土壤微生物影響有限，但通過長期的定點(diǎn)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥對(duì)土壤理化性質(zhì)和微生物多樣性均有明顯的影響。但長期施用有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性、微生態(tài)環(huán)境的影響和機(jī)理、以及土壤微生物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)功能調(diào)控機(jī)理的研究較少。

3.3 結(jié)合環(huán)境因素分析有機(jī)肥對(duì)微生物多樣性的影響

環(huán)境對(duì)有機(jī)肥料的影響研究甚少，環(huán)境因素（如光，溫度，水）能影響有機(jī)肥的腐解速率和程度。相同的有機(jī)肥在不同的地區(qū)因氣候和環(huán)境的不同對(duì)土壤微生物多樣性和植株的生長影響差異很大。如筆者在研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，南方地區(qū)在烤煙移栽前，穴施的固體有機(jī)肥比澆施的液體有機(jī)肥效果會(huì)好很多，因?yàn)槟戏?—4月潮濕多雨，澆施的液體肥料易隨雨水的沖刷而流失，從而造成有機(jī)肥對(duì)微生物多樣性的影響變小，而穴施的固體有機(jī)肥受雨水影響較小。

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