松果菊苷標準樣品的研制

王婷婷，趙敏，王岱杰，鄭媛媛，任漢書，耿巖玲*

（1.山東農(nóng)業(yè)工程學院，山東　濟南　251100；2.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東省分析測試中心，山東　濟南　250014；3.廣饒縣中醫(yī)院，山東　東營　370523）

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

松果菊苷標準樣品的研制

王婷婷1，趙敏1，王岱杰2，鄭媛媛3，任漢書3，耿巖玲2*

（1.山東農(nóng)業(yè)工程學院，山東濟南251100；2.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東省分析測試中心，山東濟南250014；3.廣饒縣中醫(yī)院，山東東營370523）

摘要：建立了松果菊苷標準樣品的研制方法。采用柱色譜和高速逆流色譜聯(lián)用對松果菊苷進行分離制備，采用質(zhì)譜、紫外、紅外和核磁等方法對松果菊苷進行結(jié)構(gòu)表征，并進行均勻性和穩(wěn)定性檢驗。經(jīng)國內(nèi)8個有資質(zhì)的實驗室聯(lián)合定值，松果菊苷標準樣品的標準值為99.15%，不確定度值為0.66%（置信度95%），達到國家標準樣品的技術(shù)要求，可用于松果菊苷檢測和相關(guān)產(chǎn)品的分析測試和質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：松果菊苷；標準樣品；均勻性；穩(wěn)定性；定值

肉蓯蓉（HerbaCistanche）為列當科肉蓯蓉屬植物的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，又名金筍、地精，具有補腎壯陽、填精補髓、養(yǎng)血潤燥和悅色延年等功效，在抗老防衰類方劑中僅次于人參占第2位［1－2］，具有極好的藥用價值，素有“沙漠人參”之稱［3］?，F(xiàn)代研究表明，其所含化學成分主要包括苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類和木脂素類［4－5］。松果菊苷（圖1）是苯乙醇苷類化合物，是肉蓯蓉中的主要化學成分，也是該藥材質(zhì)量評價的指標性成分，該成分具有抗氧化、保護神經(jīng)以及調(diào)節(jié)免疫等多種功能［6－7］。市場上銷售的松果菊苷對照品差異很大，而且沒有權(quán)威的定值核準，使用起來準確性不高。為了保證松果菊苷檢測結(jié)果的準確性，解決肉蓯蓉產(chǎn)品分析及質(zhì)控所面臨的難題，本實驗室進行了符合國標要求的松果菊苷標準樣品的研制并獲得國家標準樣品的批號。

圖1　松果菊苷的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1　Chemical　structure　of　Echinacoside

1　實驗部分

1.1儀器

中壓制備色譜儀（美國ISCO公司）；EMC-360C高速逆流色譜儀（北京艾美林科技有限公司）；Waterse2695高效液相色譜（美國Waters公司）；Agilent6520Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Aglient公司）；UV-2550型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；Vertex70紅外光譜儀（德國Bruker公司）；INOVA600mHz核磁共振波譜儀（美國Varian公司）。

1.2原料與試劑

肉蓯蓉（山東中醫(yī)藥大學中魯醫(yī)院）；聚酰胺，100～200目（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇為色譜純，乙醇、乙酸乙酯、正丁醇和丙酮等均為分析純（天津市四友精細化學品有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

1.3樣品制備

1.3.1松果菊苷粗提物的提取

藥材2.5kg粉碎，用70%乙醇回流提取3次，每次2h。將提取液進行合并，減壓濃縮至一定體積，置于通風櫥內(nèi)揮發(fā)至無明顯醇味。先用石油醚去除脂溶性成分，然后用正丁醇進行萃取，得正丁醇部分浸膏。

1.3.2松果菊苷的富集

浸膏加水稀釋，?用聚酰胺柱色譜分離，水、乙醇為流動相洗脫，收集25%乙醇洗脫液，蒸干得到初步粗提物53.1g；取20g樣品通過中壓制備色譜以C18為填料進行二次富集，甲醇-0.5%醋酸水溶液（30：70，V/V）為流動相，流速為20mL/min，收集含松果菊苷色譜分離峰，凍干得富集后的提取物8.5g，備用。

1.3.3高速逆流色譜分離

按照經(jīng)過篩選的溶劑系統(tǒng)將乙酸乙酯-正丁醇-水（5：0.5：5，V/V）混合，分層后靜置0.5h后將上下兩相分開，等體積的上下相將260mg樣品充分溶解；將溶劑系統(tǒng)的固定相（上相）用泵以l5mL/min流速泵入；開啟速度控制器，順時針方向旋轉(zhuǎn)；800r/min且旋轉(zhuǎn)穩(wěn)定后以lmL/min的流速泵入流動相（下相），待流動相開始流出逆流色譜且檢測器讀數(shù)穩(wěn)定后進樣，根據(jù)紫外吸收進行樣品收集，合并相同組分，除去有機溶劑，凍干，得到144mg高純度單體。

1.4純度分析方法

等度液相分析：色譜柱C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇：水（0.5%甲酸）（30：70，V/V）。流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；運行時間：30min；檢測波長：326nm。

梯度液相分析：色譜柱C18（250mm×4.6mm，5μm）。流動相：A為甲醇，B為0.5%甲酸水。梯度洗脫：0～20min，30%A；20～35min，30%A～100%A。流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：326nm。

薄層鑒別條件：乙酸乙酯：甲醇：甲酸（7：1：2，V/V）和乙酸乙酯：丙酮：甲酸（4：1：1，V/V），熒光和硫酸乙醇顯色劑兩種方法分別檢驗?zāi)繕宋锛兌取?/p>

質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源，正離子模式，毛細管電壓4.0kV，普氮：10L/min，溫度：300℃，掃描范圍為m/z＝100～1000。

1.5結(jié)構(gòu)鑒定

通過檢測分子量、最大吸收波長和紅外光譜的吸收情況，結(jié)合核磁共振手段進行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.6均勻性檢驗

參考GB/T15000.3-2008標準樣品工作導則要求［8］，隨機順序抽樣進行檢測。從分裝后的樣品中隨機抽取10瓶樣品，按1-3-5-7-9-2-4-6-8-10、2-4-6-8-10-1-3-5-7-9、10-9-8-7-6-5-4-3-2-1共3個順序進行隨機抽樣，每瓶稱取3份質(zhì)量分別為0.2mg的松果菊苷，用甲醇溶解并過微孔濾膜，采用等度液相條件分析，方差分析法判斷均勻性。

1.7穩(wěn)定性檢驗

以甲醇和乙腈為溶劑，檢測目標化合物在這兩種溶劑中的穩(wěn)定狀況。樣品置于2～8℃的冰箱內(nèi)進行保存，在兩年內(nèi)每6個月進行一次取樣測定，以高效液相色譜法測定5次的平均值為準，用t檢驗統(tǒng)計分析［8］，觀察其穩(wěn)定性。

1.8定值

采用8個實驗室聯(lián)合定值的方法［8］，每個實驗室3瓶，高效液相色譜法平行測定2次，采用峰面積歸一化法計算。

2　結(jié)果與討論

2.1純度分析

對獲得的松果菊苷樣品進行等度和梯度兩種液相檢測方式分析，采用二極管陣列檢測器對其進行全波長3D模式掃描，從譜圖上看未見明顯的雜質(zhì)，可以看出目標物具有很高的純度。在326nm下進行檢測，扣除溶劑峰后進行面積歸一化定量分別為99.10%和99.12%。從薄層色譜圖可以看出，乙酸乙酯：甲醇：甲酸（7：1：2，V/V）和乙酸乙酯：丙酮：甲酸（4：1：1，V/V）展開體系Rf值分別為0.62和0.46，符合化合物薄層測試的范圍要求，熒光和硫酸乙醇顯示樣品純凈。多種方式的聯(lián)合檢驗可判斷出目標物純度高，雜質(zhì)含量較少。

2.2結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)單體化合物鑒定的常規(guī)手段，研制過程采用UV、IR、MS和NMR相結(jié)合的方法對松果菊苷樣品進行鑒定，數(shù)據(jù)如下：

表1　松果菊苷的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)（氘代溶劑DMSO）Table　1　1H-NMR　data　of　Echinacoside（DMSO）

表2　松果菊苷的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)（氘代溶劑DMSO）Table　2　13C-NMR　data　of　Echinacoside（DMSO）

續(xù)表2

以上結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)與文獻［9］進行比較，確定該物質(zhì)為松果菊苷。

2.2均勻性檢驗

獲得的松果菊苷標準樣品均勻性通過F檢驗，分析其和正態(tài)分布的符合狀況并進行評判，結(jié)果見表3～5。

表3　均勻性檢驗的測量數(shù)據(jù)（%）Table　3measuring　data　of　homogeneity　test（%）

表4　每瓶的平均值、方差和測量次數(shù)Table　4mean　value，variance　andmeasurement　times　of　each　bottle　sample

表5　均勻性研究的方差分析Table　5　Variance　analysis　of　homogeneity　test

重復(fù)性標準偏差可由MSwithin計算

均勻性檢驗的不確定度ubb＝sbb＝0.01。

計算結(jié)果組間、組內(nèi)分別為υ1＝9、υ2＝20，查F臨界值表可知F0.05（9，20）＝2.94，由于F＝MSamong/MSwithin＝2.21＜F0.05（9，20），所以本樣品是均勻的。

2.3穩(wěn)定性檢驗

標準樣品的穩(wěn)定性是用來描述標準樣品的特性值隨時間變化的情況，標準樣品在規(guī)定的條件下儲存，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，其描述的性能數(shù)值應(yīng)保持在規(guī)定的限量范圍內(nèi)。

表6　穩(wěn)定性檢驗測量數(shù)據(jù)Table　6measuring　data　of　stability　test

斜率可以用下式計算

截距由下式計算

直線上的點的標準偏差可由下式計算

取其平方根s＝0.03，與斜率相關(guān)的不確定度用下式計算

自由度為n－2和P＝0.95（95%置信水平）的分布t因子t0.95，n－2＝3.182。

由于

｜b1｜＜t0.95，n－2·s（b1）＝3.182×0.002＝0.0064。

即︱b1︱＜0.0064，斜率的變化不顯著，即松菊苷標準樣品在兩年內(nèi)有較好的穩(wěn)定性，其穩(wěn)定性誤差在允許范圍內(nèi)。

松果菊苷樣品兩年有效期內(nèi)穩(wěn)定性的不確定度為：u＝sb·t＝0.002×24＝0.048。

擴展不確定度ults＝2u＝0.10。

2.4定值

定值是指采用技術(shù)上有效的方法，確定樣品的一個或多個特征值的程序。采用高效液相色譜峰面積歸一化法計算出松果菊苷標準樣品的純度，定值結(jié)果見表7。

表7　松果菊苷定值結(jié)果統(tǒng)計分析表Table　7　Statistical　analysis　of　Echinacoside　certification　results

3　結(jié)論

根據(jù)GB/T15000.3-2008標準樣品工作導則及天然產(chǎn)物標準樣品的研制規(guī)范，本實驗室開展了松果菊苷國家實物標樣的研制，并對獲得的目標樣品按照要求進行了檢測，產(chǎn)品特性符合天然產(chǎn)物標準樣品的規(guī)范要求。研制的松果菊苷標準樣品可以解決目前肉蓯蓉藥材及相關(guān)產(chǎn)品分析檢測的準確性難以保證的問題，同時為檢測結(jié)果提供量值保證。

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PreparationofthecertifiedreferencematerialofEchinacoside

WANGTing-ting1，ZHAOmin1，WANGDai-jie2，ZHENGYuan-yuan3，RENHan-shu3，GENGYan-ling2*

（1.ShandongAgricultureandEngineeringUniversity，Jinan251100，China；2.ShandongProvincialKeyLaboratoryofTCMQualityControlTechnology，ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014，China；3.GuangraoCountyTraditionalChinesemedicineHospital，Dongying370523，China）

Abstract：WepresentedpreparationtechniqueofthecertifiedreferencematerialforEchinacoside.Weemployedcolumnchromatographyandhigh-speedcountercurrentchromatographytoseparateandprepareEchinacoside，andmS，UV，IRandNMRtoelucidateitschemicalstructure.Wealsocheckeditshomogeneityandstability.Itwasthencooperativelycertifiedthrougheightdomesticqualifiedlaboratories.Resultsshowthatithascertifiedvalueof99.15%，expandeduncertaintyof0.66%（correspondingtoconfidencecoefficientof95%）.Thisdemonstratesthatitconformswithtechnicalrequirementsonacertifiedreferencematerial，soitcanbeappliedtoEchinacosidedetectionandanalysisandtestandqualitycontrolofrelativeproducts.

Keywords：Echinacoside；certifiedreferencematerial；homogeneity；stability；certification

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026（2016）01-0014-07

DOI：10.3976/j.issn.1002－4026.2016.01.003

收稿日期：2015-07-22

基金項目：2013國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201310243）；山東省科技發(fā)展計劃（2014GZX219003）

作者簡介：王婷婷（1986－），女，碩士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。Email：383766725＠qq.com

*通訊作者，耿巖玲（1973－），女，副研究員，研究方向為天然產(chǎn)物提取分離及標準樣品制備。Email：gengyanling＠126.com