草莓枯萎病菌的分離鑒定及防治藥劑篩選

伊海靜，陳　艷，劉正坪，王有年，楊　曉，劉　俊

(1.北京農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　102206；2.中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所，北京　100101)

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草莓枯萎病菌的分離鑒定及防治藥劑篩選

伊海靜1，陳艷1，劉正坪1，王有年1，楊曉1，劉俊2

(1.北京農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；2.中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所，北京100101)

摘要草莓枯萎病是目前危害北京草莓產(chǎn)業(yè)的主要病害，為篩選出安全有效的殺菌劑，采用組織分離法從北京昌平地區(qū)采集的草莓枯萎病株中分離到引起草莓枯萎病的病原菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段鑒定該病原菌為尖孢鐮刀菌草莓?；?Fusarium oxysporum Schlecht f.sp.fragariae Winks et Williams)。采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)14種殺菌劑進(jìn)行篩選，其中，206.7 g/L噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉、φ=25%腈菌唑、w=60%嘧菌酯、w=70%代森錳鋅、w=75%百菌清、w=50%異菌脲7種殺菌劑對(duì)草莓枯萎病具有顯著的抑菌效果，其EC50值分別為0.003、0.63、0.73、5.91、8.90、78.54、229.09 mg/L；另外，206.7 g/L 噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉、w=70%代森錳鋅和w=75%百菌清4種殺菌劑的藥效可持續(xù)96 h以上，其他3種藥劑處理48 h后對(duì)草莓枯萎病的抑制效果顯著下降。因此，206.7 g/L噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉、w=70%代森錳鋅和w=75%百菌清是草莓枯萎病防治的優(yōu)先選擇。

關(guān)鍵詞草莓枯萎病；尖孢鐮刀菌；EC50；殺菌劑防效

草莓(FragariaananassaDuchesne)，屬宿根性多年生草本植物，具有易栽培、產(chǎn)量高、經(jīng)濟(jì)效益好等特點(diǎn)。近年來(lái)，草莓已成為重要的經(jīng)濟(jì)作物，隨著草莓設(shè)施栽培面積的不斷擴(kuò)大，草莓枯萎病在一些主要種植區(qū)普遍發(fā)生，危害程度也逐年加重[1]。當(dāng)草莓連作種植時(shí)，植株發(fā)病率可高達(dá)89.2%[2]。草莓枯萎病的致病菌為半知菌亞門、瘤座菌科、鐮孢屬、尖孢鐮刀菌草莓?；?FusariumoxysporumSchlecht. f. sp.fragariaeWinks et Williams)[3]，主要分布在日本和韓國(guó)，在中國(guó)的局部地區(qū)有分布[4]。該病菌不僅可以通過(guò)農(nóng)具、種苗、土壤灌溉水等方式傳播，也可以通過(guò)病殘?bào)w傳播，菌絲體或厚垣孢子隨病殘?bào)w遺落土中或在未腐熟的帶菌肥料或種子上越冬，病菌在病株分苗時(shí)傳播蔓延。當(dāng)草莓栽培時(shí)厚垣孢子便開(kāi)始萌發(fā)，從根部傷口侵入，在根和莖的維管束內(nèi)繁殖、生長(zhǎng)發(fā)育并形成小型分生孢子，并在導(dǎo)管中移動(dòng)、增殖，堵塞維管束并分泌毒素破壞植株正常生長(zhǎng)疏導(dǎo)機(jī)能從而引起植株萎蔫。該病可在苗期或開(kāi)花至收獲期發(fā)病，植株一旦發(fā)病將會(huì)造成結(jié)實(shí)率降低、果實(shí)膨大異常、品質(zhì)下降、產(chǎn)量大幅度降低等后果，嚴(yán)重影響草莓產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益與持續(xù)發(fā)展[5]。

草莓連作所致枯萎病的防治技術(shù)包括農(nóng)業(yè)防治、物理防治、生物防治和化學(xué)防治。農(nóng)業(yè)防治主要采用作物輪作、移栽種苗前脫毒、選育抗病品種以及高架基質(zhì)栽培等技術(shù)，但該技術(shù)大大提高勞動(dòng)強(qiáng)度以及生產(chǎn)成本，未能在草莓種植中廣泛應(yīng)用。物理防治主要采用高溫土壤消毒技術(shù)，但該類方法存在勞動(dòng)強(qiáng)度大和嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題[6]。關(guān)于草莓枯萎病生物防治的研究也有報(bào)道，枯草芽孢桿菌DJ-6與吡唑醚菌酯及其混配對(duì)草莓枯萎病具有顯著的室內(nèi)抑菌活性與田間促生防病效果[7]，NF0919菌株發(fā)酵液和申嗪霉素對(duì)草莓枯萎病菌有顯著抑制作用[8]。芽孢桿菌(Bacillussp.)B501和鏈霉菌(Streptomycessp.)S506對(duì)草莓枯萎病也有一定防治效果[9]。目前，草莓枯萎病的生物防治雖然前景較好，但技術(shù)尚不成熟，無(wú)法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，因此，對(duì)該病害的防治仍以化學(xué)防治為主。長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外防治草霉連作引起的根部病害主要依靠溴甲烷、氯化苦等[10-12]，但該措施帶來(lái)的環(huán)境破壞和農(nóng)殘問(wèn)題直接影響人類身體健康，引起人們的廣泛關(guān)注。且溴甲烷已被多數(shù)國(guó)家禁用[12]，中國(guó)也于2011年禁止溴甲烷在草莓生產(chǎn)中使用(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1586號(hào))。目前，常用百菌清、代森錳鋅、多菌靈和甲基托布津等殺菌劑防治草莓枯萎病,因連續(xù)多年使用這些藥劑，防治效果逐年降低，甚至達(dá)到無(wú)法控制的程度[7,13]。因此，尋找安全高效的替代防治措施迫在眉睫。

北京市的設(shè)施草莓種植面積已經(jīng)超過(guò)500 hm2[14]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前草莓枯萎病在北京地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，設(shè)施栽培模式形成的高溫高濕小氣候環(huán)境加劇病害的發(fā)生。為防止單一、頻繁、過(guò)量地使用化學(xué)殺菌劑，使病菌產(chǎn)生抗藥性，本研究以廣譜殺菌劑百菌清為陽(yáng)性對(duì)照，選擇14種(包括百菌清)低毒、安全且未被廣泛應(yīng)用于防治草莓枯萎病的生物或化學(xué)農(nóng)藥，測(cè)定各藥劑對(duì)草莓枯萎病菌生長(zhǎng)的抑制作用，以期對(duì)比篩選出防效明顯、環(huán)境友好的草莓枯萎病殺菌劑。

1材料與方法

1.1病樣采集

草莓枯萎病樣本于2014年10月采集于北京市昌平區(qū)草莓基地。草莓苗為組培脫毒幼苗，品種為紅顏。

1.2供試殺菌劑及來(lái)源

供試殺菌劑及來(lái)源見(jiàn)表1。

1.3草莓枯萎病原菌分離、純化及形態(tài)鑒定

采用組織分離法分離草莓枯萎病病原菌[15]，即用剪刀把病健交界處剪下，剪成長(zhǎng)約0.5 cm的小段，于φ=75%酒精浸泡30 s后在10 g/L次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，再用無(wú)菌水沖洗3次。將表面消毒過(guò)的病組織置于PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基，28 ℃恒溫光照/黑暗(12 h/12 h)培養(yǎng)3～5 d，待菌落形成后挑取少量菌絲移植至新的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，并進(jìn)一步通過(guò)單孢分離法純化培養(yǎng)，于PDA斜面培養(yǎng)基保存，備用。

表1　供試殺菌劑及來(lái)源

1.4草莓枯萎病原菌分子生物學(xué)鑒定

采用生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)的新型基因組DNA快速抽提試劑盒(真菌)提取草莓枯萎病菌DNA。用真菌rDNA-ITS(Nuclear ribosomal internal transcribed spacer)序列通用引物ITS4和ITS5[16](ITS4：5′-R GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；ITS5：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)及草莓枯萎病菌EF-1α(translation elongation factor 1-alpha gene)序列引物EF1ya 和EF2ya[17](EF1ya:5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′；EF2ya：5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′)，草莓枯萎病菌Btub (Beta-tubulin gene)序列引物bt2a和bt2b[18](bt2a：5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′；bt2b：5′- ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×TaqPCR StarMix with loading Dye (GenStar) 25 μL，10 μmol/L的上/下游引物各1 μL，50 mg/L真菌DNA提取液1 μL，加純凈水定容至50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。PCR產(chǎn)物于12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，在GenBank的核酸序列庫(kù)進(jìn)行同源性分析，選取同源性較高的菌株，通過(guò)MEGA 5.0 軟件的MCL(Maximum Composite Likelihood)法計(jì)算進(jìn)化距離，構(gòu)建種間系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5草莓枯萎病原菌致病性測(cè)定

草莓人工培養(yǎng)接種方法見(jiàn)文獻(xiàn)[15]，接種后，轉(zhuǎn)入28 ℃溫室培養(yǎng)，14 d后調(diào)查病害，記錄植株的發(fā)病嚴(yán)重程度，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。同時(shí)，再次分離發(fā)病植株的病原菌。

1.6不同殺菌劑對(duì)草莓枯萎病原菌的室內(nèi)藥效測(cè)定

殺菌劑毒力測(cè)定方法采用菌絲生長(zhǎng)速率法[19]。每個(gè)藥劑根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)5個(gè)質(zhì)量濃度處理(表2)，供試藥劑按有效成分含量分別用無(wú)菌水稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度梯度的母液。

表2　14種殺菌劑的質(zhì)量濃度

將相應(yīng)體積藥劑分別加入到滅菌且降溫至45～50 ℃的PDA培養(yǎng)基，充分混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿，制成一系列設(shè)定質(zhì)量濃度的含藥培養(yǎng)基平板(表2)，每平板培養(yǎng)基的體積均為15 mL，冷卻后備用。每處理重復(fù)3次，以不加藥劑的PDA平板為對(duì)照(CK)。草莓枯萎病菌在PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)4 d后，從菌落邊緣用打孔器(直徑為5 mm)打取菌餅，分別接種于預(yù)先準(zhǔn)備好的含藥PDA培養(yǎng)基平板中央，每皿接1個(gè)菌餅，每質(zhì)量濃度藥劑設(shè)3次重復(fù)。

平板在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h和96 h后，分別用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。將抑菌率換算成抑制機(jī)率值作為縱坐標(biāo)，藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，根據(jù)抑菌率機(jī)率值(y)與藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)(x)間的線性回歸關(guān)系，求毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)，計(jì)算有效中質(zhì)量濃度(Median effective mass concentration 50，EC50)，比較各供試藥劑的抑制效果及病原菌對(duì)各供試藥劑的敏感性。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用DPS7.5軟件的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較分析。采用SPSS 20軟件計(jì)算不同殺菌劑的EC50值。

2結(jié)果與分析

2.1草莓枯萎病菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

從發(fā)病草莓根部病健交界處分離到5個(gè)菌株(編號(hào)為CM001～CM005)，其菌落和形態(tài)學(xué)特征無(wú)明顯差異。選擇代表菌株CM001進(jìn)行Koch’s準(zhǔn)則的驗(yàn)證。

平板培養(yǎng)與顯微觀察結(jié)果表明(圖1)，病原菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d后，菌落呈白色，氣生菌絲絨狀。鏡下小型分生孢子較多，卵形或腎形，0～1個(gè)隔膜，無(wú)色。大型分生孢子彎月形、鐮刀形，較勻稱，具1～4個(gè)隔膜，多數(shù)為3～4個(gè)隔膜。厚垣孢子單生或串生，球形[20]。

使用通用引物ITS4/ITS5對(duì)菌株CM001的rDNA-ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為512 bp的DNA序列(GenBank No. KT833080)，該序列與GenBank中尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的rDNA-ITS(GenBank: KJ699122.1)序列相似度達(dá)到100%；同時(shí)，使用鐮刀菌特有引物EF1ya/EF2ya對(duì)菌株CM001的轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)基因EF-1α進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其DNA長(zhǎng)度為648 bp(GenBank No. KT895270)，與尖孢鐮孢菌的EF-1α(GenBank: KP025958.1)序列相似度也達(dá)到100%；另外，通過(guò)使用β-微管蛋白基因Btub的引物(bt2a/bt2b)對(duì)菌株CM001進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條約291 bp的序列片段(GenBank No. KT895271),與NCBI比對(duì)后發(fā)現(xiàn)待測(cè)真菌與尖孢鐮孢菌的Btub(GenBank: KR072629.1)相似度也達(dá)到100%。另見(jiàn)MEGA5.0軟件構(gòu)建Btub基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。因此，通過(guò)和GenBank庫(kù)中的3個(gè)重要鑒別基因(rDNA-ITS,EF-1α,Btub)的序列比對(duì)，可以證明：分離到的草莓枯萎病菌為尖孢鐮刀菌草莓?；虵usariumoxysporumSchlecht f. sp.fragariaeWinks et Williams。

A. PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)　Colony morphology in PDA medium；B. 大型分生孢子　Macroconidia；C. 小型分生孢子　Microconidia

圖2　CM001菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2草莓枯萎病菌致病性測(cè)定結(jié)果

待測(cè)菌株接種草莓幼苗14 d后觀察幼苗發(fā)病癥狀，結(jié)果顯示，發(fā)病初期葉片卷縮或呈波狀產(chǎn)生畸形葉莖，老葉呈紫紅色萎蔫，后葉片枯黃，最后全株枯死(圖3-B)；對(duì)照無(wú)發(fā)病癥狀，正常生長(zhǎng)(圖3-A)。

2.3不同殺菌劑對(duì)草莓枯萎病原菌防治效果評(píng)價(jià)

草莓枯萎病菌的抑菌作用測(cè)定結(jié)果表明，14種藥劑對(duì)FusariumoxysporumSchlecht f.sp.fragariaeWinks et Williams 的抑制效果差異明顯(圖4)，在設(shè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨藥劑質(zhì)量濃度的增加，抑菌效果呈現(xiàn)明顯增強(qiáng)的趨勢(shì)。其中，草莓枯萎病原菌菌絲生長(zhǎng)48 h后的測(cè)定結(jié)果表明， 7種殺菌劑，包括206.7 g/L噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉、φ=25%腈菌唑、w=60%嘧菌酯、w=70%代森錳鋅、w=75%百菌清和w=50%異菌脲的抑菌效果顯著，在質(zhì)量濃度Ⅰ時(shí)，206.7 g/L 噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)、w=70%代森錳鋅和w=75%百菌清的抑菌率均達(dá)到100%；w=50%異菌脲、φ=25%腈菌唑、w=60%嘧菌酯的抑制率均達(dá)到50%以上；其他殺菌劑抑菌效果不顯著。

A.健康草莓植株(對(duì)照)Heathy plant (CK)；B.感病草莓植株Diseased plant

圖3人工接種草莓幼苗14 d后植株發(fā)病情況

Fig.3The symptom of infected strawberry

seedlings on 14 d post inoculation

菌落為草莓枯萎病菌在不同質(zhì)量濃度含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h后的狀態(tài) The colonies growth state ofFusariumoxysporumSchlecht f.sp.fragariaeWinks et Williams cultivated for 48 h in media included different concentrations fungicides；A. 206.7 g/L噁酮·氟硅唑206.7 g/L Famoxadone · Flusilazole；B. 寡雄腐霉Pythiumoligandrum；C.φ=25%腈菌唑φ=25% Myclobutanil；D.w=60% 嘧菌酯w=60% Azoxystrobin；E.w=70%代森錳鋅w=70%Mancozeb；F.w=75%百菌清w=75%Chlorothalonil；G.w=50%異菌脲w=50%Iprodione；質(zhì)量濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ依次降低10倍，對(duì)照無(wú)藥劑添加Mass concentration from 1 to 5 decreases with 10 times,the concentrations ofⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,and Ⅴwere decreased 10 times in sequence,the control (CK) is no fungicides addition

圖47種殺菌劑對(duì)草莓枯萎病菌菌絲的抑制效果

Fig.4The inhibiting effect of 7 fungicides on the mycelial growth of the strawberryFusariumwilt pathogen

草莓枯萎病原菌菌絲生長(zhǎng)48 h的測(cè)定結(jié)果表明，206.7 g/L 噁酮·氟硅唑抑制作用最強(qiáng)， EC50均值為3×10-3mg/L,其次為寡雄腐霉、φ=25%腈菌唑、w=60%嘧菌酯、w=70%代森錳鋅、w=75%百菌清和w=50%異菌脲，EC50值分別為0.63、0.73、5.91、8.90、78.54和229.09 mg/L。毒力回歸方程的斜率反映病原菌對(duì)藥劑的敏感性，斜率越大，病原菌對(duì)藥劑的敏感性越高，即隨著質(zhì)量濃度的增大，抑菌率明顯增大。求得的毒力回歸方程的斜率表明，草莓枯萎病菌對(duì)寡雄腐霉最敏感，其次為代森錳鋅和噁酮·氟硅唑(表3)。

14 種殺菌劑抑制草莓枯萎病菌的持效期差異明顯，噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉、百菌清、代森錳鋅4種殺菌劑不僅抑菌效果顯著，且持效期比其他殺菌劑長(zhǎng)，其抑制效果未隨施藥時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低，在最大施用質(zhì)量濃度下(質(zhì)量濃度Ⅰ)，206.7 g/L噁酮·氟硅唑的抑制率分別為100%(48 h)、100%(96 h)；寡雄腐霉的抑菌率分別為100%(48 h)、80.81%(96 h)；w=70%代森錳鋅的抑制率分別為100%(48 h)、100%(96 h)；w=75%百菌清的抑菌率分別為83.78%(48 h)、81.25%(96 h)，這4種抑菌效果顯著、藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的殺菌劑是田間藥劑施用的最佳選擇。而另外4種殺菌劑的抑制率隨施藥時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降，如φ=25%腈菌唑的抑制率分別為77.67%(48 h)、58.69%(96 h)；w=60%嘧菌酯的菌率分別為89.06%(48 h)、79.34%(96 h)；w=50%異菌脲的抑菌率分別為87.74%(48 h)、83.29%(96 h)(圖5)。

表3　不同殺菌劑對(duì)草莓枯萎病菌的EC50值

注： EC50值為抑制菌絲生長(zhǎng)50%時(shí)的藥劑質(zhì)量濃度。

Note：EC50represents the mass concentration of the fungicides of mycelial growth is inhibited 50%.

3結(jié)論與討論

草莓根腐病是近幾年溫室草莓生產(chǎn)上遇到的較難防治的土傳病害，尤其是在多年種植草莓的重茬地塊， 嚴(yán)重時(shí)可造成整個(gè)草莓區(qū)的毀園。草莓根腐病的致病菌種類繁多，目前世界草莓主產(chǎn)區(qū)報(bào)道的草莓根腐病致病菌已達(dá)20多種。北京地區(qū)也先后鑒定出立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等多種致病真菌[20]。然而，有關(guān)致病菌的種下劃分尚未見(jiàn)報(bào)道。草莓枯萎病菌(FusariumoxysporumSchlecht f. sp.fragariaeWinks et Williams)是引起草莓根腐的一種重要病原菌，引起草莓根部腐爛，進(jìn)而使整株枯萎死亡。主要分布在日本、韓國(guó)，在中國(guó)的局部地區(qū)有分布[4]。近年來(lái)，草莓枯萎病在中國(guó)的一些主要種植區(qū)普遍發(fā)生，危害程度也逐年加重。多種致病真菌引起的癥狀相似，容易混淆，對(duì)病害防治帶來(lái)一定的困難。因此，正確鑒定草莓根腐的病原菌及篩選防治藥劑對(duì)田間防治病害有重要的指導(dǎo)意義。根據(jù)北京昌平地區(qū)草莓根腐病樣的組織分離，得到致病菌分離物，致病性測(cè)定結(jié)果表明，該菌株為草莓枯萎病的病原菌。在傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上，結(jié)合rDNA-ITS、 EF-1α和Btub序列分析，對(duì)草莓枯萎病的病原菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，該病原菌為半知菌亞門、瘤座菌科、鐮孢屬、尖孢鐮刀菌草莓專化型(FusariumoxysporumSchlecht f. sp.fragariaeWinks et Williams)。在對(duì)采集到的草莓病原真菌進(jìn)行分子鑒定時(shí)，除采用真菌通用的核糖體rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)序列的引物外，還針對(duì)鐮刀菌轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子基因( EF-1α)和β-微管蛋白基因(Btub)設(shè)計(jì)引物，2對(duì)引物補(bǔ)充使用可以避免ITS無(wú)法避免的自身缺陷，即種內(nèi)差異的現(xiàn)象?？蔀椴葺菸≈虏【目焖勹b定提供依據(jù)。

A. 206.7 g/L噁酮·氟硅唑206.7 g/L Famoxadone · Flusilazole；B. 寡雄腐霉Pythiumoligandrum；C.φ=25%腈菌唑φ=25% Myclobutanil；D.w=60%嘧菌酯w=60% Azoxystrobin；E.w=70%代森錳鋅w=70%Mancozeb；F.w=75%百菌清w=75%Chlorothalonil；G.w=50%異菌脲w=50%Iprodione

圖57種殺菌劑對(duì)F.oxysporum菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

Fig.5Inhibitory effect of 7 fungicides on the growth ofF.oxysporum

同時(shí)，通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法，篩選14種容易獲得且低毒的生物農(nóng)藥和化學(xué)農(nóng)藥對(duì)草莓枯萎病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，旨在篩選出抑菌效果顯著、藥效持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的殺菌劑。殺菌劑室內(nèi)藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，在供試的14種殺菌劑中，206.7 g/L噁酮·氟硅唑乳油可濕性粉劑對(duì)草莓枯萎病菌藥效最強(qiáng)，EC50值為0.003 mg/L,其次為寡雄腐霉、腈菌唑、嘧菌酯、w=70%代森錳鋅、w=75%百菌清、異菌脲，EC50值分別為0.63、0.73、5.91、8.90、78.54和229.09 mg/L。對(duì)殺菌劑抑制草莓枯萎病菌的持效期測(cè)定結(jié)果表明，206.7 g/L噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉、w=70%代森錳鋅以及w=75%百菌清不僅抑菌效果顯著，持效期也較長(zhǎng)，是田間施藥較為理想的選擇。因此，除所選的陽(yáng)性對(duì)照百菌清以外，206.7 g/L噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉、w=70%代森錳鋅是新篩選的效果較為理想的殺菌劑。

在14種待篩選的殺菌劑中，有4種生物制劑，10種化學(xué)制劑。在4種生物制劑種，寡雄腐霉屬于微生物制劑，φ=0.5%大黃素甲醚屬于植物源殺菌劑，還有2種為抗生素類殺菌劑分別為w=72%硫酸鏈霉素和φ=4%農(nóng)抗120， 這4種對(duì)人畜低毒的環(huán)境友好型殺菌藥劑適合應(yīng)用到有機(jī)蔬菜的生產(chǎn)中。除上述4種生物制劑外，還測(cè)試了其余10種化學(xué)殺菌劑，結(jié)果顯示，206.7 g/L噁酮·氟硅唑乳油對(duì)草莓枯萎病菌的抑菌效果最好，并且持效期也較長(zhǎng)。206.7 g/L噁酮·氟硅唑是由噁唑菌酮和氟硅唑2種殺菌劑組成，復(fù)配具有增效作用，兼具觸殺和內(nèi)吸的功能，可抑制甾醇脫甲基化，延緩抗性菌株的產(chǎn)生[19,21]。而寡雄腐霉的抑制作用僅次于前者，寡雄腐霉作為微生物殺菌劑，其本質(zhì)是自然界中存在的一種攻擊性很強(qiáng)的寄生真菌，也能在多種農(nóng)作物根圍定殖，是下一步對(duì)控制草莓枯萎病的田間試驗(yàn)的較好的藥劑選擇[22-23]。作為陽(yáng)性對(duì)照，百菌清的抑菌效果顯然低于206.7 g/L 噁酮·氟硅唑、寡雄腐霉和w=70%代森錳鋅。綜上所述，本研究結(jié)果對(duì)防治草莓枯萎病的農(nóng)藥選擇具有重要意義。

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Isolation and Identification of StrawberryFusarium

Received 2015-10-23Returned2015-11-26

Foundation itemThe Scientific Research Foundation of Beijing Municipal Education Commission in 2015 (No.KM201510020004); Key Laboratory of Urban Agriculture (North) Ministry of Agriculture (No.KFK2015001).

First authorYI Haijing,female,master student. Research area:research control technology of plant disease. E-mail:345736209@qq.com

WANG Younian,male,professor. Research area:fruit ecological security. E-mail:wyn1951@126.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Wilt Pathogen and Fungicides Screening

YI Haijing1,CHEN Yan1,LIU Zhengping1,WANG Younian1,YANG Xiao1and LIU Jun2

(1. Key Laboratory of Urban Agriculture (North) Ministry of Agriculture,Beijing University of Agriculture,Beijing102206,China; 2. Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China)

AbstractStrawberry Fusarium wilt is a major threat of strawberry industry in Beijing. In order to screen for the safe and effective fungicides to control strawberry Fusarium wilt spreading in Beijing area,tissue isolation method were used to isolate the casual agent that caused Fusarium wilt of the strawberry in Changping district of Beijing.The pathogen was identified as Fusarium oxysporum Schlecht f. sp. fragariae Winks et Williams through morphological,molecular biological methods and pathogenicity analysis. Subsequently,14 fungicides were screened by the mycelium growth rate method. According to the value of EC50,7 fungicides showed significant inhibitory effect on the pathogen of strawberry Fusarium wilt,which were 206.7 g/L famoxadone · flusilazole,Pythium oligandrum,φ=25% myclobutanil,w=60% azoxystrobin,w=70% mancozeb,w=75% chlorothalonil,and w=50% iprodione,which EC50value is respectively 0.003,0.63,0.73,5.91,8.90,78.54,and 229.09 mg/L. Moreover,inhibitory effect of 4 fungicides,including 206.7 g/L famoxadone · flusilazole,Pythium oligandrum,w=70% mancozeb,and w=75% chlorothalonil,lasted for 96 h; however,the inhibitory effect of the remaining 3 fungicides significantly decreased after 48 h. Therefore,4 fungicides,including 206.7 g/L famoxadone · flusilazole,Pythium oligandrum,w=70% mancozeb and w=75% chlorothalonil,are the best choice of field fungicide application for strawberry Fusarium wilt.

Key wordsStrawberry; Fusarium wilt; Fusarium oxysporum; EC50; Efficacy of fungicides

收稿日期：2015-10-23修回日期：2015-11-26

基金項(xiàng)目：北京市教委2015年度科研計(jì)劃(KM201510020004)；農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(KFK2015001)。

通信作者：陳艷，女，講師，博士，從事植物病害防治技術(shù)研究。E-mail：cheny@bua.edu.cn

中圖分類號(hào)S432

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)04-0626-10

Corresponding authorCHEN Yan,female,lecturer,Ph.D. Research area:research control technology of plant disease. E-mail:cheny@bua.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-04-02

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1118.040.html

第一作者：伊海靜，女，碩士，研究方向?yàn)橹参锊『Ψ乐渭夹g(shù)。E-mail：345736209@qq.com

王有年，男，教授，從事果品優(yōu)質(zhì)生態(tài)安全研究。E-mail：wyn1951@126.com