小鼠觸須毛囊外根鞘再生的體外培養(yǎng)液優(yōu)化及α-SMA的表達鑒定

唐 瑤　鄧梅成　王海濤　付靈慧　李樹偉

(塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室/塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

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小鼠觸須毛囊外根鞘再生的體外培養(yǎng)液優(yōu)化及α-SMA的表達鑒定

唐 瑤鄧梅成王海濤付靈慧李樹偉*

(塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室/塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

摘要【目的】 為建立小鼠毛囊體外培養(yǎng)模型，篩選適合小鼠觸須毛囊外根鞘離體培養(yǎng)的培養(yǎng)液，并進行α-SMA (α-平滑肌肌動蛋白)表達的免疫熒光鑒定。 【方法】 選擇出生5 d內(nèi)的乳鼠斷頸法處死，利用顯微解剖技術(shù)，分離觸須毛囊外根鞘。并分別培養(yǎng)于無血清、含5% FCS、10% FCS的DMEM、MEM共計6種不同培養(yǎng)液中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，制作冰凍切片并進行H.E.染色，在顯微鏡下觀察乳鼠觸須毛囊外根鞘的再生情況，篩選培養(yǎng)液。在最適培養(yǎng)液中培養(yǎng)乳鼠觸須毛囊外根鞘，利用α-SMA 抗體進行乳鼠觸須毛囊外根鞘再生部位α-SMA表達的熒光鑒定。 【結(jié)果】觀察到小鼠觸須毛囊外根鞘中段再生的初期結(jié)構(gòu)特征，并且 5% FCS MEM培養(yǎng)液是最適合小鼠觸須毛囊外根鞘的體外培養(yǎng)液，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)α-SMA在毛囊外根鞘再生部位有表達?！窘Y(jié)論】 5% FCS MEM培養(yǎng)液是比較適合小鼠觸須毛囊外根鞘的體外培養(yǎng)液，α-SMA的表達可以作為毛囊再生的檢測指標(biāo)之一。

關(guān)鍵詞小鼠毛囊； 觸須； 外根鞘； 免疫熒光； α-SMA抗體

毛囊不僅是脊椎動物皮膚上皮及真皮的附屬物，毛囊還是體表關(guān)鍵的環(huán)境感測器，對動物外貌和身體的熱量維護具有重要作用。目前，治療各種脫發(fā)疾病一般采用自體毛發(fā)移植，自體毛發(fā)移植雖可減少排異反應(yīng)，但自體毛發(fā)數(shù)量有限，遠遠不能滿足患者的需求，毛囊再生及其機制的研究成為迫切需要解決的問題。國內(nèi)外對于毛囊的再生也進行了大量的探索，研究表明毛囊外根鞘在毛發(fā)的再生與創(chuàng)傷愈合中具有重要作用，Driskell等[1]報道毛囊外根鞘是由一群未分化的角質(zhì)細胞組成，且某些細胞擁有干細胞的多能性。Ohyama等[2]報道，毛囊外根鞘是毛囊干細胞的富集區(qū)，在形態(tài)上，毛囊外根鞘細胞與表皮層的角質(zhì)細胞具有一定的相似性，兩者在組織結(jié)構(gòu)的形成上也有較好的延續(xù)性，并且在條件合適的情況下兩者可以互相轉(zhuǎn)化，能夠參與組織損傷修復(fù)及毛發(fā)的再生。 Rachel[3]等報道毛囊外根鞘細胞還可以釋放一些細胞生長因子及少量激素，在一定條件下誘導(dǎo)時具有廣泛的分化潛能[4]。外根鞘細胞這一特性提高了細胞的生物完整性，也表明外根鞘細胞具有成體干細胞的潛在特性。目前，大多數(shù)毛囊體外培養(yǎng)研究主要是先獲得外根鞘細胞，再進行體外培養(yǎng)研究細胞特性，但外根鞘組織由多種類型的細胞構(gòu)成，這樣就有可能破壞外根鞘原有的再生功能。與人發(fā)毛囊相比，小鼠觸須的毛囊比較大，進行顯微解剖觸須毛囊比較容易分離出所需的外根鞘。Higgins 等[5]對人發(fā)毛囊真皮乳頭進行培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)成功并傳代。毛囊外根鞘再生模型是研究毛囊的生長周期和毛囊生長的影響因素的良好模型，同時也能為毛發(fā)移植和毛發(fā)再生的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料：從新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購買成年健康并處于發(fā)情期的昆明小鼠雌雄各5只，共10只，然后以在塔里木大學(xué)實驗室繁殖得到的新生乳鼠作為實驗材料。

1.1.2主要試劑：一抗α-SMA 兔抗小鼠多克隆抗體購自武漢三鷹生物工程有限公司，二抗山羊抗兔keyFluor488熒光檢測試劑盒、山羊血清購自凱基生物科技有限公司，基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM和MEM購自 Gibco 公司，青/鏈霉素濃縮液購自重慶西南藥業(yè)，HistoChoice、胎牛血清(FCS)購自Sigma公司，其它生化常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純：DAPI染液、抗熒光猝滅劑、DPBS、蘇木精、伊紅、OCT包埋劑、Triton X-100 原液。

1.1.3主要儀器：CO2培養(yǎng)箱、Leica冰凍切片機、Olympus顯微鏡、Zeiss倒置熒光顯微鏡。

1.2方法

1.2.1新生小鼠觸須毛囊外根鞘分離培養(yǎng)

斷頸法處死新生3 d的乳鼠，整個乳鼠放入75% 酒精中消毒, 然后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺，在解剖顯微鏡下用眼科剪沿乳鼠嘴角剪下雙側(cè)觸須部皮膚組織，分離出觸須毛囊，切除毛囊真皮乳頭部分，拔出內(nèi)根鞘，獲得毛囊外根鞘。將其分別培養(yǎng)于無血清、含5% FCS、10% FCS的DMEM和MEM共計6種不同培養(yǎng)液中(見表1)，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，在OCT包埋前，顯微鏡下統(tǒng)計外根鞘再生個數(shù)，每組實驗重復(fù)3次，篩選優(yōu)化培養(yǎng)液。

表1　乳鼠觸須毛囊外根鞘體外培養(yǎng)液優(yōu)化設(shè)計表

1.2.2新生小鼠觸須毛囊外根鞘冰凍切片的制備

利用OCT冰凍包埋劑對6組培養(yǎng)4 d的觸須毛囊外根鞘分別進行包埋，液氮速凍，然后放入-80°超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。利用冰凍切片機制作厚度約8 μm的冰凍切片，標(biāo)記編號并放入-20°冰箱中備用。

1.2.3新生小鼠觸須毛囊外根鞘H.E.染色

從-20°冰箱中取出冰凍切片，電吹風(fēng)吹干30 min，蒸餾水清洗5 min，然后用蘇木素染液染色3～5 min左右，蒸餾水洗去染色液，用1%鹽酸酒精處理5 s，繼而放入蒸餾水中1 min，再放入伊紅染液染色30 s，梯度酒精脫水，HistoChoice透明，晾干中性樹膠封片，Olympus顯微鏡下拍照觀察。

1.2.4新生小鼠觸須毛囊外根鞘免疫熒光檢測

取5% FCS MEM組2張冰凍切片，電吹風(fēng)吹干30 min，4% PFA(多聚甲醛)固定30 min，PBS (pH7.2 ～ 7.4) 沖洗2次，1% Triton X-100透膜20 min，3% BSA+10% 山羊血清各250 μL混合滴加切片，放入濕盒避光孵育1 h，輕輕倒去孵育液，然后滴加100 μL的α-SMA多克隆抗體稀釋液 (α-SMA∶山羊血清∶3% BSA =1∶1∶98), 以PBS代替一抗做陰性對照，4 ℃濕盒孵育過夜，PBS沖洗2次 ，添加二抗keyFluor488及DAPI，室溫下濕盒避光孵育1 h，PBS沖洗2次，封片，暗房熒光拍照。

2結(jié)果與分析

2.1小鼠觸須毛囊外根鞘再生情況

將6組不同培養(yǎng)液中的小鼠觸須毛囊外根鞘在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)4 d整后，在Olympus 顯微鏡下觀察并統(tǒng)計具有再生狀態(tài)外根鞘的個數(shù)，計算出外根鞘在6組培養(yǎng)液中的再生百分比(見表2)

表2　乳鼠觸須毛囊外根鞘再生情況統(tǒng)計表

2.2小鼠觸須毛囊結(jié)構(gòu)和外根鞘再生形態(tài)學(xué)觀察

將乳鼠觸須毛囊進行外科顯微解剖得到完整觸須毛囊，制作切片H.E.染色觀察觸須毛囊結(jié)構(gòu)，包括外根鞘、內(nèi)根鞘、毛干、毛母質(zhì)、毛乳頭等部分組成。Schlake等[6]研究表明毛囊的最深處是位于角質(zhì)層3～6 mm的毛乳頭，它具有神經(jīng)和血管，并向毛干提供毛囊生長所需的營養(yǎng)，毛囊的最外側(cè)是外根鞘。對解剖出的完整昆明乳鼠觸須毛囊再進行顯微解剖得到離斷下1/3毛球部的毛囊，然后拔出內(nèi)根鞘后獲得外根鞘，內(nèi)根鞘和外根鞘之間有一層玻璃膜(glass membrane、GM)，可以用來區(qū)分毛囊中部細胞的再生(Regeneration cells、RCS)。

圖1a為完整的0 d新生小鼠毛囊結(jié)構(gòu)，具有毛囊球部、內(nèi)根鞘及毛干。圖1b為顯微解剖的0 d新生小鼠毛囊外根鞘結(jié)構(gòu)，已經(jīng)去除了毛囊球部、內(nèi)根鞘及毛干部分，僅剩外根鞘部分。

圖2　無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d的小鼠毛囊外根鞘

圖2a和2b分別是無血清的DMEM和MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)乳鼠毛囊外根鞘4 d后H.E.染色結(jié)果，從圖中可以發(fā)現(xiàn)毛囊外根鞘的中部在OCT包埋時，由于內(nèi)根鞘的剔除，把外根鞘中的空間擠壓成一條線，而且在玻璃膜的內(nèi)部沒有新生細胞出現(xiàn)。

圖3　在5% FCS培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d的小鼠毛囊外根鞘

圖3a和3b分別是含5% FCS的DMEM和MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d后H.E.染色結(jié)果，顯微鏡下可以看到新生細胞填充了玻璃膜內(nèi)部，圖3a再生部位其外面部分呈淡紫色，結(jié)構(gòu)上由外根鞘延續(xù)而來。圖3b中再生部位其外面部分呈深紫色，結(jié)構(gòu)上同樣由外根鞘延續(xù)而來，新生外層細胞致密，體積小，核為卵圓形，其內(nèi)層細胞也同樣致密，再生細胞連續(xù)性好。

圖4　10% FCS培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d的小鼠毛囊外根鞘

圖4a和4b 分別是含10% FCS的DMEM和MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d后H.E.染色結(jié)果，顯微鏡下可以看到圖4a中，玻璃膜混亂不完整，毛囊中部細胞雖再生但無規(guī)則，再生后失去毛囊結(jié)構(gòu)。在圖4b 中，毛囊再生情況明顯要比圖4a中好，玻璃膜清晰，但再生細胞體積大，細胞核為圓形，部分核已空泡化，再生結(jié)構(gòu)松散，可以看出沒有圖3b中的再生細胞結(jié)構(gòu)致密。

2.3α-SMA在小鼠觸須毛囊外根鞘再生中的表達

將新生小鼠毛囊外根鞘冰凍切片分別用H.E.染色和α-SMA抗體免疫熒光染色。免疫熒光組織化學(xué)染色切片以不加抗體作為陰性對照，以加α-SMA抗體作為陽性實驗組。

圖5　小鼠毛囊外根鞘的α-SMA抗體免疫熒光對照組

從圖5可見，由于對照組是用PBS代替一抗做陰性對照，從免疫熒光結(jié)果上可以看出只有細胞核被DAPI染成藍色熒光(圖5b)，沒有發(fā)現(xiàn)488的綠色熒光。

圖6　小鼠毛囊外根鞘的α-SMA抗體免疫熒光實驗組

從圖6中可以看到在陽性實驗組中有α-SMA的陽性表達(488綠色熒光)，如圖中箭頭所示(圖6b)，圖6c顯示了細胞核DAPI藍色熒光，黃色箭頭所指是緊貼玻璃膜再生細胞的細胞核。

3討論

前期的研究表明，與人發(fā)毛囊相比，小鼠觸須毛囊較大，顯微解剖法易于分離外根鞘，且鼠齡容易控制，結(jié)果穩(wěn)定，因而本研究采取游離小鼠觸須毛囊外根鞘進行氣液界面三維培養(yǎng)。另外，毛囊外根鞘細胞可以釋放一些細胞生長因子，并且毛囊外根鞘形態(tài)再生涉及外根鞘細胞之間一系列復(fù)雜的相互作用。為了獲取完整的觸須毛囊，使用顯微外科解剖技術(shù)，沒有經(jīng)過胰酶和膠原酶的消化，故較好的保留了毛囊的生長活性及再生功能。

Ito M等人[7]研究發(fā)現(xiàn)毛囊球部是毛囊干細胞另一富集區(qū)。本研究將真皮乳頭切除干凈，即切除毛囊下1/3部分，拔出內(nèi)根鞘，獲得所需外根鞘。在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后顯微觀察發(fā)現(xiàn)，4種含有FCS的培養(yǎng)液中外根鞘再生百分率不同，在無血清的培養(yǎng)液中，外根鞘幾乎不再生，而5% FCS MEM的培養(yǎng)液條件下毛囊外根鞘的再生率最高。因此，5% FCS MEM培養(yǎng)液為本研究中最適合小鼠觸須毛囊外根鞘再生的體外培養(yǎng)液，毛囊外根鞘細胞的再生狀況較好；并且同一FCS濃度時，DMEM培養(yǎng)外根鞘細胞再生的效果不如MEM好。

針對在此優(yōu)化的培養(yǎng)液條件下外根鞘培養(yǎng)時間范圍，發(fā)現(xiàn)再生良好的外根鞘從第6天開始呈塌陷狀態(tài)，而且，培養(yǎng)到第9天，外根鞘細胞萎縮或者開始死亡。因此延長外根鞘體外培養(yǎng)時間將是下一步需要探究的問題。培養(yǎng)液中加入不同濃度的FCS，由于血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，為外根鞘再生提供了營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子。H.E.染色結(jié)果對比表明，血清是促進毛囊外根鞘再生的一個很重要的因素，血清中各種營養(yǎng)成分充足并且其中的生長因子有利于毛囊外根鞘的再生。

α-SMA作為細胞骨架蛋白的一種，在細胞再生及維持細胞形態(tài)中具有重要作用，因此，α-SMA的表達是細胞再生的標(biāo)志之一。在本實驗中的免疫熒光檢測結(jié)果顯示，α-SMA 在5% FCS MEM的培養(yǎng)條件下再生的毛囊外根鞘中可以見到陽性表達，由此也更進一步說明毛囊外根鞘具有成體干細胞的潛能。

4結(jié)論

4.1對日齡3 d的昆明乳鼠觸須毛囊外根鞘體外培養(yǎng)結(jié)果表明，毛囊外根鞘再生的最適培養(yǎng)液條件為5% FCS MEM的培養(yǎng)液。

4.2對再生的毛囊外根鞘進行α-SMA免疫熒光檢測，在毛囊外根鞘中心部位顯示有α-SMA的表達。

參考文獻

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Optimization Medium of Culturing the Mice Whisker Outer Root Sheath in Vitro and Identification of Expression of α-SMA

Tang YaoDeng MeichengWang HaitaoFu Linghui Li Shuwei*

(Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resource in Tarim Basin of Xinjiang Production &Construction Corps/College of Life Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

Abstract【Objective】 To establish the mouse follicle in vitro culture model， optimized the culture medium of the mice outer root sheath, and detected α-SMA (α-smooth muscle actin) expression by immunofluorescence. 【Methods】 Newborn mice were sacrificed from cervical, isolated mice outer root sheath with microsurgical dissection, and cultured in 6 kinds of medium such as serum-free, 5% FCS (fetal calf serum) and 10% FCS DMEM or MEM respectively. Put them in 5% CO2 incubator at 37℃ for 4 days, embedding and frozen section, and then H.E. staining. The mice outer root sheath regeneration were observed under the microscope observation to select the best culture medium. Rat vibrissa follicle outer root sheath were cultured in the optimum culture liquid, and Immunoflourescence analysis the newborn mice outer root sheath regeneration with α-SMA antibody.【Results】The early stage of the mice follicle outer root sheath regeneration were observed. 5% FCS MEM medium were suitable culture medium for the mice outer root sheath regeneration. Immunofluorescence analysis found that α-SMA expressed at the region of regeneration.【Conclusion】5% FCS MEM medium were more suitable for culturing mice outer root sheath in vitro, and α-SMA expression could be used as indicator to detect the whisker follicle regeneration.

Key wordsmice follicle; whisker; outer root sheath; immunofluorescence; α-SMA antibody

中圖分類號：Q954.539

文獻標(biāo)識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.02.001

文章編號：①1009-0568(2016)02-0001-07

作者簡介：唐瑤(1993-)，女，生物科學(xué)16級本科，研究方向為生物技術(shù)。E-mail：308930016@qq.com*為通訊作者E-mail：xj_lsw@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31560685)，國家級大學(xué)生創(chuàng)新項目(201410757009)，塔里木大學(xué)校級大學(xué)生創(chuàng)新項目(2014010)，塔里木大學(xué)研究生科研創(chuàng)新校級指導(dǎo)項目(TDGRI201521)。

收稿日期：①2015-11-09