TGF-β1通過調節(jié)miR-155表達影響胃癌相關巨噬細胞表型的研究

張艷青， 馬禮丹， 孫 芮， 彭 妍， 龐 磊， 李 艷， 鄧 彬

1.揚州大學非編碼RNA研究中心，江蘇 揚州 225001； 2.常州市第一人民醫(yī)院病理科； 3.揚州大學附屬醫(yī)院消化科

論著·胃癌

TGF-β1通過調節(jié)miR-155表達影響胃癌相關巨噬細胞表型的研究

張艷青1， 馬禮丹1， 孫 芮1， 彭 妍2， 龐 磊1， 李 艷1， 鄧 彬3

1.揚州大學非編碼RNA研究中心，江蘇 揚州 225001； 2.常州市第一人民醫(yī)院病理科； 3.揚州大學附屬醫(yī)院消化科

目的 探討miR-155參與TGF-β1對胃癌微環(huán)境中的巨噬細胞分型的調控機制。方法 免疫組織化學法檢測胃癌組織內(nèi)M2型巨噬細胞標志物CD163的表達和TGF-β1的表達；定量PCR檢測胃癌細胞上清培養(yǎng)佛波酯誘導的巨噬細胞中miR-155的表達水平，并觀察將TGF-β1受體阻滯后，胃癌細胞上清對miR-155表達的影響；利用雙熒光素酶報告基因實驗探討miR-155對TGF-β1信號通路上的TGF-β1受體Ⅱ的靶向調控作用。結果 胃癌組織中CD163、TGF-β1的表達顯著高于癌旁組織；胃癌細胞上清作用于佛波酯誘導的巨噬細胞后，巨噬細胞內(nèi)miR-155表達顯著降低， TGF-β1作用于巨噬細胞后，miR-155表達降低，而阻斷TGF-β1受體作用后，miR-155的表達回升。佛波酯誘導的巨噬細胞中過表達miR-155可使細胞分泌IL-10減少，IL-12增加。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示miR 155可靶向負調控TGF-β1受體Ⅱ。結論 胃癌微環(huán)境中的TGF-β1可以降低腫瘤相關巨噬細胞內(nèi)miR-155的表達，后者具有調節(jié)巨噬細胞分型的作用，miR-155可通過調節(jié)TGF-β1受體Ⅱ對TGF-β1信號通路進行負反饋調節(jié)。

胃癌； 轉化生長因子； 微小RNA-155；腫瘤相關巨噬細胞

大多數(shù)的實體腫瘤組織中約50%的細胞是巨噬細胞，大量的腫瘤相關巨噬細胞與惡性腫瘤的不良預后密切相關。巨噬細胞是異質群體，通常分為 M1(經(jīng)典激活型)和M2型(替代激活型)兩種表型。M1型巨噬細胞是由IFNγ 和其他促炎癥刺激誘導激活，產(chǎn)生促炎細胞因子，激活 Th1反應，一般介導抗腫瘤效應。M2型巨噬細胞是由IL-10、免疫復合物、糖皮質激素、IL-4 和 IL-13等誘導激活，參與受損組織的修復、免疫調節(jié)和促腫瘤發(fā)展。

轉錄因子C/EBPβ是調控巨噬細胞向M2極化的重要轉錄因子，而miR-155由于可以作用于C/EBPβ負調控該轉錄因子的表達，而對巨噬細胞的極化也有重要的調控作用[1-2]。研究證明巨噬細胞過表達miR-155可增加促炎因子的產(chǎn)生，增強T細胞反應[3]。因此，miR-155具有調控巨噬細胞向M1極化的作用，TGF-β1可誘導巨噬細胞向M2型極化，兩者之間是否具有相互調控關系，值得進一步研究。本研究探討TGF-β1與miR-155調控巨噬細胞極化之間的相互調控關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌組織：胃癌組織樣本取自揚州大學附屬醫(yī)院行外科切除術胃癌患者。收集40例樣本，每例分為癌組織和癌旁組織。

1.1.2 細胞：胃癌細胞系SGC-7901和人單核細胞系THP-1為揚州大學醫(yī)學院免疫學實驗室提供，人胃黏膜細胞GES1購自中科院上海細胞庫。

1.1.3 主要試劑： TGF-β1單克隆抗體和CD163單克隆抗體分別購自Santa Cruz公司和北京中杉公司，TGF-β1受體阻斷劑購自Merck公司，重組人TGF-β1細胞因子及Elisa試劑盒均購自Peprotech公司，佛波酯購自Sigma公司，RPMI 1640及DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司， 反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Roche公司，質粒構建所需酶均購自NEB公司，PCR引物由上海生工公司合成，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學檢測：按照試劑盒說明書進行，染色判斷標準：每張切片在高倍鏡下(400×)隨機選取10個視野，細胞出現(xiàn)棕黃色染色為陽性。根據(jù)German Immunoreactive Score(RIS)標準基于圖像分析系統(tǒng)計算各切片免疫組化得分[4]。該評分方法結合免疫陽性細胞比率和染色強度：細胞無染色計0分；1%～10%細胞染色計1分，11%～50%細胞染色計2分，51%～80%細胞染色計3分，81%～100%細胞染色計4分；染色強度陰性為0分，有少量淡黃色顆粒，明顯高于背景染色計1分；可見較多深棕色顆粒計2分；如有大量深棕色或褐色顆粒計3分。根據(jù)染色強度和陽性細胞百分率綜合分析：0～1分為陰性；2～3分為弱陽性；4～5分為中度陽性；5～6分為強陽性。陽性率(%)=(弱陽性+中度陽性+強陽性)/總數(shù)×100%。

1.2.2 佛波酯(PMA)誘導巨噬細胞及條件培養(yǎng)基培養(yǎng)：THP-1細胞生長狀態(tài)良好時，將細胞傳代接種于6孔板中，每孔約含1×105個/ml，再用50 ng/ml佛波酯誘導THP-1細胞24 h，使其分化為巨噬細胞。THP-1細胞誘導為巨噬細胞后，細胞呈貼壁狀態(tài)，吸去舊培養(yǎng)基，加入含15%胃癌細胞培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細胞。

1.2.3 實時定量PCR檢測：Trizol試劑提取細胞總RNA，利用特異性miR-155逆轉錄引物將總RNA逆轉錄為cDNA，分別用miR-155的PCR引物和內(nèi)參照U6的PCR引物進行定量PCR反應。

1.2.4 質粒構建及病毒包裝：將miR-155基因組序列克隆至逆轉錄病毒載體pMSCV-PIG中，與病毒包裝輔助質粒一起轉染至293T細胞，包裝病毒；將TGF-β1受體Ⅱ(TGFBRⅡ)的mRNA序列3′不翻譯區(qū)(3′UTR)克隆至熒光素酶報告基因載體pGL3。

2 結果

2.1 胃癌組織及癌旁組織中CD163和TGF-β1的表達 CD163作為M2型巨噬細胞的表面分子標記，主要表達在巨噬細胞的胞膜；TGF-β1作為一種生長因子，主要表達在腫瘤細胞的胞質。在胃癌組織中CD163的表達和TGF-β1的表達均顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖1、表1)。

表1 胃癌和癌旁組織中CD163和TGF-β1陽性表達

Tab 1 Positive expressions of CD163 and TGF-β1 in gastric carcinoma and adjacent tissues

組別例數(shù)CD163陰性弱陽性中度陽性強陽性陽性率[n(%)]TGF?β1陰性弱陽性中度陽性強陽性陽性率[n(%)]胃癌組織4021818238(95．0)18181339(97．5)癌旁組織4012207128(70．0)91512431(77．5)χ2值8．658167．314249P值0．0032560．006841

2.2 胃癌細胞上清培養(yǎng)巨噬細胞下調miR-155表達 分別取含有胃癌細胞SGC-7901和胃黏膜細胞GES-1培養(yǎng)上清的培養(yǎng)液培養(yǎng)PMA誘導的巨噬細胞，檢測巨噬細胞內(nèi)miR-155的表達量，發(fā)現(xiàn)胃癌細胞上清(tumor supernatant，TSN)處理的巨噬細胞內(nèi)miR-155表達明顯降低；TGF-β1處理的巨噬細胞內(nèi)miR-155顯著降低，用TGF-β1受體阻滯劑處理的SGC-7901細胞培養(yǎng)上清作用于巨噬細胞，miR-155的表達又趨回升(見圖2)。

圖1 免疫組織化學染色(400×) A:胃癌組織； B:癌旁組織

Fig 1 Results of Immunohistochemistry (400×) A: gastric cancer tissue; B: paracarcinoma tissue

注：**P<0.01。

圖2 不同條件下定量PCR檢測巨噬細胞內(nèi)miR-155表達

Fig 2 The expression of miR-155 in macrophage at different situations

2.3 miR-155促進巨噬細胞向M1表型轉化 TGF-β1作用于巨噬細胞后，與空白對照組比較，其分泌IL-10的水平顯著升高，分泌IL-12的水平顯著降低(P<0.01)，而過表達miR-155的巨噬細胞接受TGF-β1刺激后，與未含miR-155的空載體對照組相比，其分泌IL-10的水平顯著降低，分泌IL-12的水平顯著升高(P<0.01)。

注：**P<0.01。

圖3 Elisa 檢測miR-155對巨噬細胞分泌IL-10和IL-12的影響

Fig 3 Effects of miR-155 on the release of IL-10 and IL-12 by macrophage

2.4 MiR-155靶向調控TGFBRⅡ 通過生物信息學檢索發(fā)現(xiàn)，miR-155的種子序列與TGFBRI和TGFBRⅡ均存在潛在的互補關系，熒光素酶報告基因實驗結果顯示miR-155能顯著降低帶有TGFBRⅡ 3′UTR的熒光素酶活性。Western blotting實驗結果顯示miR-155可以下調TGFBR2蛋白的表達水平(見圖4)。

注：*P<0.05。

3 討論

實體瘤微環(huán)境中有多種免疫細胞浸潤，其中巨噬細胞約占腫瘤間質免疫細胞總數(shù)的50%以上，被稱為腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophage, TAM)。大量實驗證實存在于腫瘤微環(huán)境中的TAM多為替代活化型巨噬細胞，即M2型。M2型巨噬細胞分泌抗炎因子如IL-10，具有免疫抑制功能，是促進腫瘤生長、侵襲、轉移以及血管生成的重要因素[5]。研究顯示，多種腫瘤細胞分泌的TGF-β1是導致腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞趨向M2型極化的重要因子[6]。同時，M2型巨噬細胞也可以分泌TGF-β1來下調免疫應答效應。因此，TGF-β1對于TAM的分化及功能是一種重要的調控因子。

miR-155是近年來研究較多的一種內(nèi)源性非編碼微小RNA，其功能主要集中于炎癥、免疫調節(jié)中。在巨噬細胞中，miR-155具有負反饋調節(jié)Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)信號通路的作用[7-8]；SMAD2磷酸化是TGF-β信號傳導通路的關鍵點，有研究結果顯示，在巨噬細胞中miR-155可通過靶向抑制SMAD2蛋白表達，影響細胞對TGF-β信號的反應[9]。因此，miR-155和TGF-β信號通路之間具有復雜的相互關系。miR-155可能對巨噬細胞信號通路的穩(wěn)態(tài)調節(jié)至關重要。miR-155的表達異常會使巨噬細胞信號通路穩(wěn)態(tài)打亂，導致發(fā)生相關病理生理改變。本研究結果顯示在胃癌組織中，M2型巨噬細胞標志物CD163的表達與胃癌細胞TGF-β1的表達均明顯增高，且胃癌細胞分泌的TGF-β1可下調巨噬細胞內(nèi)miR-155的表達，miR-155可調控巨噬細胞向M1型活化，并通過靶向負調控TGFBRⅡ對TGF-β1通路具有負調節(jié)作用。

胃癌組織中浸潤巨噬細胞與胃癌臨床預后密切相關，有研究顯示胃癌腫瘤間質中浸潤的巨噬細胞可促進胃癌進展，預后較差。CD163陽性巨噬細胞密度是胃癌預后的獨立預測標記[10]。我們的實驗結果也表明胃癌組織中CD163陽性巨噬細胞數(shù)目明顯高于癌旁組織。胃癌中TGF-β1的表達普遍升高，TGF-β1可調控腫瘤微環(huán)境中各種細胞的功能參與腫瘤的發(fā)展過程，包括促進上皮細胞間質轉化、抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤血管生成等[11]。TGF-β1作為負性免疫調控因子還可抑制NK細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力[12]，誘導T細胞轉化為調節(jié)性T細胞(Tregs)[13]，介導腫瘤免疫逃逸。我們對臨床胃癌患者組織標本行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織TGF-β1在胃癌組織中的表達明顯增加，且主要分布于胃癌細胞胞漿內(nèi)，提示胃癌細胞分泌是TGF-β1的主要來源。胃癌組織中TGF-β1與巨噬細胞活化表型之間的分子機制值得進一步研究。

本研究中，不管是TGF-β1還是胃癌細胞培養(yǎng)上清均可下調巨噬細胞內(nèi)miR-155水平，利用TGF-β1受體阻滯劑處理巨噬細胞后，發(fā)現(xiàn)miR-155的表達得到恢復。這說明TGF-β1可以下調周圍巨噬細胞內(nèi)miR-155表達。有文獻報道TGF-β1可明顯降低肺成纖維細胞內(nèi)miR-155表達，過表達miR-155可促進細胞遷移[14]；有趣的是，在鼠乳腺上皮細胞中，TGF-β1可以上調miR-155表達，這種誘導作用是通過SMAD4實現(xiàn)的。抑制miR-155可以抑制TGF-β1誘導的上皮間質轉化[15]。因此，在調控miR-155表達方面，在不同的細胞內(nèi)，TGF-β1將引起不同的效應。這說明TGF-β1和miR-155的作用均存在細胞和環(huán)境依賴性。因此，需要弄清楚在不同細胞中miR-155的不同靶蛋白及其確切調控機制。

文獻報道m(xù)iR-155可誘導巨噬細胞極化，可促進巨噬細胞向M1型活化。本研究中巨噬細胞過表達miR-155其分泌的抗炎因子IL-10明顯減少，促炎因子IL-12明顯增多。胃癌細胞分泌的TGF-β1使巨噬細胞內(nèi)miR-155表達降低，這導致了胃癌微環(huán)境中的巨噬細胞向M2型活化，具有促進腫瘤發(fā)展的作用。 已有研究證明miR-155可以靶向調控TGF-β1信號通路的SMAD2影響巨噬細胞對TGF-β1信號的反應性[9]。miR-155也可以通過調控C/EBPβ影響腫瘤相關巨噬細胞炎癥因子的產(chǎn)生[16]。本研究結果首次發(fā)現(xiàn)miR-155還可以調控TGFBRⅡ進而影響TGF-β1信號產(chǎn)生的效應。通過以上研究結果，可以推測一方面TGF-β1下調巨噬細胞miR-155表達，使巨噬細胞趨向M2型活化，另一方面，miR-155的下調可使TGFBRⅡ表達增加，增強TGF-β1對巨噬細胞的調節(jié)效應。

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(責任編輯：馬軍)

TGF-β1 induces the polarization of macrophage infiltrated in gastric cancer through regulating the expression of miR-155

ZHANG Yanqing1, MA Lidan1, SUN Rui1, PENG Yan2, PANG Lei1, LI Yan1, DENG Bin3

1.Non-coding RNA Center, Yangzhou University, Yangzhou 225001; 2.Department of Pathology, the First People’s Hospital of Changzhou City; 3.Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Yangzhou University, China

Objective To investigate the mechanisms of TGF-β1 in gastric cancer microenvironment mediated macrophage differentiation.Methods Immunohistochemical method was used to detecte the expressions of CD163 and TGF-β1 in gastric cancer tissue and corresponding paracarcinoma tissues; RT-PCR was used to detecte the expressions of miR-155 in phorbol myristate acetate (PMA) induced macrophage cultured in the supernatant of gastric cancer cells and observe the effect of TGF-β1 receptor blocker on the expression of miR-155; dual luciferase reporter gene assay was used to verify TGF-β1 receptor Ⅱ as the target of miR-155.Results The expressions of CD163， TGF-β1 in gastric cancer tissues was also higher than those in paracarcinoma tissues; when cultured in the supernatant of gastric cancer cells, the expression of miR-155 in PMA induced macrophage was decreased significantly.TGF-β1 could decrease the expression of miR-155 in PMA induced macrophage and TGF-β1 receptor blocker restored the level of miR-155. Overexpression of miR-155 in PMA induced macrophages reduced the secretion of IL-10 and increased the secretion of IL-12. Dual luciferase reporter gene assay showed that miR-155 targeted the 3’UTR of TGF-β1 receptor Ⅱ and decreased the expression of TGF-β1 receptorⅡ.Conclusion Altogether, our data uncover that TGF-β1 in gastric cancer micro-enviroment can decrease the expression of miR-155 in macrophages, which infulence the polarization of macrophage and reversly regulate the TGF-β1 pathway by targeting TGF-β1 receptor Ⅱ.

Gastric cancer； Transformation growth factor-β1； miR-155； Tumor associated macrophage

國家自然科學基金(81302041)；江蘇省自然科學基金(BK20130454 )；江蘇省高校自然科學基金(12KJD320007)

張艷青，講師，博士，研究方向：腫瘤分子機制。E-mail：brightyq@163.com

鄧彬，副主任醫(yī)師，博士，研究方向：消化道腫瘤基礎臨床。E-mail：83568917@qq.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.003

R735.2

A

1006-5709(2016)11-1217-04

2016-01-29