金鐵鎖離體快繁技術(shù)研究

李 斌唐軍榮陳 杰尹麗莎韓國偉于 鑫辛培堯（1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明65022；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明65022；.畢節(jié)市中藥研究所，貴州畢節(jié)551700；.武警昆明市森林支隊(duì)，云南昆明650118）

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金鐵鎖離體快繁技術(shù)研究

李 斌1，2唐軍榮1，2陳 杰3尹麗莎3韓國偉1，2于 鑫4辛培堯1，2
（1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明650224；3.畢節(jié)市中藥研究所，貴州畢節(jié)551700；4.武警昆明市森林支隊(duì)，云南昆明650118）

摘要：為了更有效保護(hù)金鐵鎖野生資源，以其嫩莖為外植體進(jìn)行快繁技術(shù)的研究。結(jié)果表明：消毒方法為清水沖洗后用75%乙醇消毒15 s，0.1%升汞消毒10 min，污染率降低至3.61%。分化培養(yǎng)基為MS + 2.0 mg/ L 6-BA+0.05 mg/ L TDZ+0.05 mg/ L NAA，平均分化芽數(shù)為3.49；增殖培養(yǎng)基為MS + 0.3 mg/ L 6-BA + 0.05 mg/ L TDZ + 0.01 mg/ L NAA，增殖倍數(shù)達(dá)4.29；生根培養(yǎng)基為1/2MS+ 0.3 mg/ L IBA+0.1 mg/ L NAA+0.3 g/ L活性炭，生根率為91.7%；組培苗轉(zhuǎn)入紅土∶腐殖土∶珍珠巖=1∶1∶1的基質(zhì)中成活率可達(dá)94.5%。該組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，對解決其野生資源貧乏及生產(chǎn)上原材料供應(yīng)不足的問題具有重要意義。

關(guān)鍵詞：金鐵鎖；離體快繁；外植體；煉苗；培養(yǎng)基

金鐵鎖（Psammosilene tunicoides）為石竹科（Caryophyllaceae）金鐵鎖屬（Psammosilene）藥用植物，是中國西南地區(qū)特有單種屬植物。金鐵鎖為中國傳統(tǒng)名藥“云南白藥”的主要成分之一，也是多種知名中成藥的主要成分［1］。近年來隨著人們對金鐵鎖藥用價(jià)值的不斷深入認(rèn)識，需求量與日俱增。但由于受自然環(huán)境因素和人為作用的影響，金鐵鎖野生資源數(shù)量急劇下降，目前已作為珍稀瀕危物種列入《中國植物紅皮書》，屬于國家二級重點(diǎn)保護(hù)植物［2］，是研究石竹科系統(tǒng)進(jìn)化非常重要的材料［3-4］。生產(chǎn)中用金鐵鎖種子進(jìn)行繁殖，發(fā)芽率極低［5］，且不能保證繁育種苗品質(zhì)的優(yōu)良性。楊耀文等［6］和李景濱等［7］先后對金鐵鎖的組培快繁進(jìn)行了研究，但培養(yǎng)基配方的不同，對金鐵鎖組培擴(kuò)繁影響較大，本研究對金鐵鎖的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，探討影響金鐵鎖離體快繁的關(guān)鍵因素，實(shí)現(xiàn)其工廠化育苗，對解決金鐵鎖由于野生資源匱乏而供不應(yīng)求的現(xiàn)狀具有重要意義。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自云南省麗江市玉龍縣，挖取長勢好、健壯、無病蟲害的植株帶回，盆栽于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，待其長出嫩莖后，采摘嫩芽作為外植體材料。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1材料預(yù)處理

外植體在洗潔精水中漂洗3～5 min，然后用流水進(jìn)行沖洗30 min。在清洗過程中對過長或過大的枝條進(jìn)行修剪，方便后續(xù)的消毒工作。

1.2.2外植體消毒

取上述預(yù)處理苗，用75%乙醇和0.1%升汞進(jìn)行消毒。75%乙醇處理的時(shí)間分別為5、10、15 s，0.1%升汞消毒時(shí)間分別為5、10、15 min。材料經(jīng)過消毒后切成長約1 cm帶腋芽的莖段，平鋪接于培養(yǎng)基MS+2.0 mg/ L 6-BA+ 0.05 mg/ L TDZ+0.05 mg/ L NAA中，附加30.0 g/ L蔗糖，5.0 g/ L瓊脂，pH 5.7。試驗(yàn)共計(jì)9個(gè)處理，每個(gè)處理5瓶，每瓶放置材料5株。

1.2.3分化培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，附加30.0 g/ L蔗糖，5.0 g/ L瓊脂，pH 5.7。6-BA、TDZ和NAA 3種激素的不同濃度和配比采用正交實(shí)驗(yàn)法設(shè)計(jì)，分別添加到培養(yǎng)基中。6-BA濃度分別為1.0、2.0、3.0 mg/ L；TDZ濃度分別為0.01、0.05、0.10 mg/ L； NAA濃度分別為0.05、0.1、0.2 mg/ L。試驗(yàn)選取健壯的無菌苗為材料，切成長約1 cm不帶腋芽的莖段，平鋪接于培養(yǎng)基中。試驗(yàn)取9組不同激素濃度配比和1組空白對照處理，共計(jì)10個(gè)處理，每個(gè)處理5瓶，每瓶放置材料5株。

1.2.4增殖培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，附加30.0 g/ L蔗糖，5.0 g/ L瓊脂，pH 5.7。6-BA、TDZ和NAA 3種激素的不同濃度和配比采用正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)，添加到培養(yǎng)基中。其中，6-BA濃度分別為0.1、0.3、0.5 mg/ L；TDZ嘗試度分別為0.01、0.05、0.10 mg/ L；NAA濃度分別為0.01、0.05、0.10 mg/ L。切取分化培養(yǎng)中獲得的長約1 cm，健壯的的芽苗，進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)取9組不同激素濃度配比和1組空白對照處理，共計(jì)10個(gè)處理，每個(gè)處理5瓶，每瓶放置材料5株。

1.2.5生根培養(yǎng)

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加30.0 g/ L蔗糖，5.0 g/ L瓊脂，pH 5.7。IBA、NAA 2種激素不同濃度與不同量的活性炭配比采用正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)，添加到培養(yǎng)基中。其中生長素IBA濃度分別為0.1、0.2、0.3 mg/ L，NAA濃度分別為0.1、0.2、0.3 mg/ L，活性炭分別添加0.1、0.2、0.3 g/ L。試驗(yàn)選取增殖培養(yǎng)中健壯的無菌苗為材料，切取長約2 cm的頂芽接入培養(yǎng)基中。試驗(yàn)取9組不同激素濃度配比和1組空白對照處理，共計(jì)10個(gè)處理，每個(gè)處理5瓶，每瓶放置材料5株。

1.2.6煉苗移栽

以紅土、腐殖土和珍珠巖為原料，配置6種不同的基質(zhì)分別為：1）全紅土；2）紅土∶珍珠巖= 1∶1；3）紅土∶腐殖土= 1∶1；4）紅土∶腐殖土∶珍珠巖=1∶1∶1；5）腐殖土∶珍珠巖= 1∶1；6）全腐殖土。將生根良好、生長健壯的金鐵鎖組培瓶苗從組織培養(yǎng)室移至普通實(shí)驗(yàn)室或溫室大棚，瓶內(nèi)煉苗5 d；然后將瓶蓋揭開1/3，放置2 d；最后將瓶口完全揭開，放置1 d后（其間注意組培苗的保濕），將苗從組培瓶中移栽至上述6種不同的基質(zhì)中。煉苗過程中，要保證基質(zhì)足夠的水分，并采取一定的遮光措施。

1.2.7培養(yǎng)條件

上述培養(yǎng)均是在溫度20℃，光照強(qiáng)度1 200 lx，光照周期12 h/ d的條件下進(jìn)行的。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0、Excel 2007等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1外植體消毒

不同處理的消毒效果見表1。由表1可知，消毒時(shí)間處理組合A7、A8、A9和A6之間無顯著差異，說明在這4種消毒條件下，均可獲得較好的消毒效果，污染率均較低，分別為4.04%、3.86%、 3.24%及3.61%。但處理A6消毒處理后，其外植體生長情況良好，其余3種處理外植體的生長情況較差。在9種處理中，污染率最高的是處理A2，污染率為32.50%。綜上所述，處理A6消毒方案（75%乙醇15 s，0.1%升汞10 min）為金鐵鎖外植體消毒的最理想條件。

表1　不同消毒處理效果比較Table 1 Comparison of different sterilization treatment effects

2.2分化培養(yǎng)

金鐵鎖嫩莖在不同的分化培養(yǎng)條件下，其分化效果不同，見表2。

表2　不同培養(yǎng)基對金鐵鎖莖段分化的影響Table 2 The influence on differentiation of P.tunicoides stem in different culture medium

由表2可知，處理B4、B6、B8之間金鐵鎖不定芽的誘導(dǎo)效果差異不顯著，均獲得較為理想的誘導(dǎo)效果。而在CK中，未獲得叢生芽，說明外源激素的加入是金鐵鎖分化培養(yǎng)的必要條件。處理B9中，雖然獲得了叢生芽，分化芽數(shù)在所有附加有外源激素處理中最低，僅為1.22；同樣在處理B4、B6、B8之間，叢生芽苗平均苗高差異不顯著，均可獲得生長較快的叢生芽。除CK以外，處理B5叢生芽平均苗高最低，為1.1 cm；而對比處理B4、B6及B8的叢生芽生長情況，以B4處理中苗的生長最為濃綠粗壯，且無玻璃化現(xiàn)象。因此，金鐵鎖莖段分化培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)方案為B4處理，即：MS + 2.0 mg/ L 6-BA+0.05 mg/ L TDZ+0.05 mg/ L NAA（圖1）。

圖1　金鐵鎖分化培養(yǎng)（30 d）Fig.1 Differentiation culture of P.tunicoides

2.3增殖培養(yǎng)

在不同的增殖培養(yǎng)條件下，金鐵鎖芽的增殖效果不同，見表3。

表3　不同培養(yǎng)基對金鐵鎖芽增殖的影響Table 3 The influence on proliferation of P.tunicoides bud in different culture medium

從表3可以看出，用金鐵鎖的頂芽來增殖，未添加激素的處理組合CK增殖系數(shù)最低，為1.33。在添加了外源激素的處理中，C8處理的增殖系數(shù)最高，為4.67；C2處理的增殖系數(shù)最低，為2.67；處理C4、C6、C8之間在平均增值倍數(shù)和增值苗高性狀方面均無顯著差異，但C4處理增殖苗長勢粗壯，苗生長效果明顯優(yōu)于處理C6和C8。因此，金鐵鎖頂芽的較佳增殖培養(yǎng)基為MS + 0.3 mg/ L 6-BA + 0.05 mg/ L TDZ + 0.01 mg/ L NAA（圖2）。

圖2　金鐵鎖增殖培養(yǎng)（30 d）Fig.2 Proliferation culture of P.tunicoides

2.4生根培養(yǎng)

不同的生根培養(yǎng)條件下金鐵鎖的生根效果見表4。

由表4可知，生根率最低的處理是未添加任何激素的對照組CK，其余D1～D9處理的生根率均在在58.3%以上。在IBA濃度不變的情況下，生根率隨著NAA濃度的升高而出現(xiàn)下降的趨勢。D7處理的生根率最高，為91.7%；平均根長也最長，為0.6 cm；但其平均苗高卻最低，為3.1 cm。從活性炭的加入量來看，活性炭加入0.1 g/ L的D1、D6、D8處理的平均生根率最低為66.7%，活性炭加入量為0.2 g/ L的D2、D4、D9處理的平均生根率為77.8%，活性炭加入量為0.3 g/ L的D3、D5、D7處理的平均生根率為77.8%，因此，活性炭的加入量為0.2～0.3 g/ L時(shí)有利于促進(jìn)生根。綜合分析認(rèn)為，D7處理1/2MS+ 0.3 mg/ L IBA + 0.1 mg/ L NAA+0.3 g/ L活性炭為金鐵鎖的最佳生根培養(yǎng)基（圖3）。

表4　不同培養(yǎng)基對金鐵鎖生根的影響Table 4 The influence on P.tunicoides rooting in different culture medium

圖3　金鐵鎖生根培養(yǎng)（30 d）Fig.3 Rooting culture of P.tunicoides

2.5煉苗移栽

不同基質(zhì)對金鐵鎖煉苗成活率的影響見表5。

表5　不同基質(zhì)對金鐵鎖煉苗的影響Table 5 The effect on acclimatization of P.tunicoides in different matrix

由表5可知，不同的移栽基質(zhì)對金鐵鎖的生根率有顯著影響。金鐵鎖組培苗的成活率最低的處理組合是E1，為66.7%；最高的是E6，為95.2%，但與處理組合E4、E5之間差異不顯著（分別為94.5%和94.9%）。因此，E4～E63個(gè)處理組合的基質(zhì)均適宜金鐵鎖的移栽煉苗。但從管理和基質(zhì)成本來看，添加一定比例的紅土有助于提高基質(zhì)的保水性，減少補(bǔ)水次數(shù)，還可以降低基質(zhì)的成本。故實(shí)際生產(chǎn)栽培過程中建議使用紅土∶腐殖土∶珍珠巖=1∶1∶1基質(zhì)配比，成活率達(dá)到94.5%。

3　結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)中，外源生長調(diào)節(jié)劑對細(xì)胞分裂、器官形成和胚胎發(fā)生起著重要的調(diào)節(jié)作用，培養(yǎng)基種類和激素配比的選擇是關(guān)鍵，研究適宜金鐵鎖腋芽誘導(dǎo)、芽增殖和生根的培養(yǎng)基配方具有重要的意義。本試驗(yàn)得出最佳的分化培養(yǎng)基為MS+ 2.0 mg/ L 6-BA + 0.05 mg/ L TDZ + 0.05 mg/ L NAA，頂芽增殖培養(yǎng)基為MS + 0.3 mg/ L 6-BA + 0.05 mg/ L TDZ+0.01 mg/ L NAA，生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg/ L IBA+0.1 mg/ L NAA+0.3 g/ L活性炭。

楊耀文等［6］以金鐵鎖幼嫩莖段為外植體，最佳的分化培養(yǎng)基為MS+ 0.1～1.0 mg/ L IAA + 0.5～1.0 mg/ L 6-BA。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適合金鐵鎖不帶葉腋莖段的最佳分化培養(yǎng)基是MS+2.0 mg/ L 6-BA + 0.05 mg/ L TDZ + 0.05 mg/ L NAA。由于TDZ的分化作用較6-BA強(qiáng)很多倍，因此，同時(shí)加入6-BA 及TDZ可明顯提高芽的分化率。

李景濱等［7］對金鐵鎖芽增殖情況進(jìn)行了研究認(rèn)為，B5+0.5 mg/ L 6-BA+0.5 mg/ L IAA+0.2 mg/ L Kt為金鐵鎖組織培養(yǎng)增殖生長的最佳培養(yǎng)基，新生叢生芽生長高大粗壯，分枝少，葉色綠。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，金鐵鎖芽苗在培養(yǎng)基MS + 0.3 mg/ L6-BA+0.05 mg/ L TDZ+0.01 mg/ L NAA中增殖產(chǎn)生的植株生長粗壯，葉色濃綠，增殖效果優(yōu)于已有相關(guān)報(bào)道?？梢?，在增殖培養(yǎng)時(shí)，加入適量的TDZ同樣可促使芽的增殖。

對金鐵鎖生根培養(yǎng)的研究表明，生根培養(yǎng)基為B5+0.1 mg/ L NAA + 0.05 mg/ L IBA，生根率為83%［7］。楊耀文等［6］也對金鐵鎖進(jìn)行了生根培養(yǎng)研究，結(jié)果表明，在1/2MS + 0.1～0.2 mg/ L NAA + 0.1～0.2 mg/ L IBA培養(yǎng)基上迅速生根，生根率可達(dá)100%。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，金鐵鎖組培苗較理想的生根培養(yǎng)方案是1/2MS + 0.3 mg/ L IBA + 0.1 mg/ L NAA+0.3 g/ L活性炭，生根率為91.7%，試驗(yàn)結(jié)果相對理想。

金鐵鎖組培苗在紅土∶腐殖土∶珍珠巖= 1∶1∶1的基質(zhì)中生長最佳，植株生長健壯，成活率達(dá)到94.5%。移栽煉苗成活率的高低，是保證金鐵鎖根的產(chǎn)量，穩(wěn)定市場需求的關(guān)鍵。為提高生根苗根系的質(zhì)量，移栽前要在室內(nèi)有光直射處煉苗7～14 d，同時(shí)也要做好對煉苗基質(zhì)的消毒處理。實(shí)踐中多采用多菌靈稀釋液進(jìn)行消毒處理，但不同的研究者的具體方法又有所差異。歐陽志勤等［8］曾將試管苗置于陰涼通風(fēng)處并打開瓶蓋煉苗3 d，取出洗凈基部培養(yǎng)基，將苗放在1 000倍多菌靈溶液中浸泡20 min，然后分別移至用1%高錳酸鉀溶液處理過的腐殖土和粉碎的椰子（Cocos nucifera）殼中，其成活率分別為20%和65%，可見，單純的腐殖土或椰殼并不能完全提供金鐵鎖幼苗生長所需的全部營養(yǎng)元素。對比不同的煉苗基質(zhì)組成發(fā)現(xiàn)，試管苗移栽成活率與基質(zhì)本身的保水、保肥、透氣性和自身穩(wěn)定性密切相關(guān)［9-12］。綜合考慮透氣性、保水性及土壤肥力等因素，并結(jié)合栽培植物的生長特性，才能做好煉苗移栽工作。試驗(yàn)表明，在全紅土的基質(zhì)組合中，生長一段時(shí)間后組培苗出現(xiàn)大量的死亡，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，其根部均已潰爛，其原因可能是基質(zhì)的通透性差，導(dǎo)致根部無氧呼吸產(chǎn)生乙醇，從而造成根部毒害。添加珍珠巖和腐殖土后，基質(zhì)粘重的情況得到明顯的改善，透氣性提高。當(dāng)采用珍珠巖和腐殖土或完全腐殖土?xí)r，基質(zhì)的透氣性極佳，但保水性相對有所下降。在管理過程中發(fā)現(xiàn)，僅采用珍珠巖和腐殖土或完全腐殖土的基質(zhì)需2～3 d進(jìn)行1次補(bǔ)水，而加有紅土的基質(zhì)5～7 d補(bǔ)水1次。由此可見，紅土、珍珠巖和腐殖土對于基質(zhì)的保水性和透氣性有較大的影響。因此，在實(shí)際的煉苗過程中，要根據(jù)所栽培苗木的生長特性，結(jié)合成活率選擇適宜的基質(zhì)進(jìn)行煉苗。

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（責(zé)任編輯韓明躍）

第1作者：李斌（1988—），男，碩士生。研究方向：林木遺傳育種與繁育。Email：445118715＠qq.com。

The Research on in Vitro Rapid Propagation of Psammosilene tunicoides

Li Bin1，2，Tang Junrong1，2，Chen Jie3，Yin Lisha1，2，Han Guowei1，2，Yu Xin4，Xin Peiyao1，2
（1.Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement＆Propagation in Universities of Yunnan Province，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；2.College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；3.Institute of Traditional Chinese Medicine of Bijie City，Bijie Guizhou 551700，China；4.Kunming Forest Detachment of Chinese People′s Armed Police Force，Kunming Yunnan 650118，China）

Abstract：In order to protect the wild resource of Psammosilene tunicoides effectively，tender stems of P.tunicoides were used as explants to study the in vitro rapid propagation technique of P.tunicoides.The results showed that the method of sterilization was that tender stems were rinsed with water，then disinfect with 75%alcohol for 15 s and 0.1%mercuric for 10 min.The contamination rate was 3.61%.Differentiation culture medium was MS + 2.0 mg/ L 6-BA + 0.05 mg/ L TDZ + 0.05 mg/ L NAA，the average quantity of differentiation bud was 3.49，proliferation culture medium was MS + 0.3 mg/ L 6-BA + 0.05 mg/ L TDZ + 0.01 mg/ L NAA，the proliferation multiple was 4.29，Rooting culture medium was 1/2MS + 0.3 mg/ L IBA + 0.1 mg/ L NAA + 0.3 g/ L activated carbon，the rooting rate was 91.7%，the tissue culture seedlings were transplanted into the matrix（red soil∶humus∶perlite=1∶1∶1），the survival rate was 94.5%.The technology of tissue culture is hopeful to solve the problem of wild resource shortage and insufficient supply of raw materials in the production.

Key words：Psammosilene tunicoides，in vitro rapid propagation，explant，acclimatization，culture medium

通信作者：辛培堯（1975—），男，博士，副教授。研究方向：林木遺傳育種與繁育。Email：xpytgyx＠163.com。

基金項(xiàng)目：西南林業(yè)大學(xué)云南省省級重點(diǎn)學(xué)科（林學(xué)）資助；云南省省院省校教育合作咨詢共建重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（No.211015）資助；西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助。

收稿日期：2015-11-20

doi：10.11929/ j.issn.2095-1914.2016.03.014

中圖分類號：S723.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-1914（2016）03-0080-06