類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者循環(huán)microRNAs生物標(biāo)志物的篩選及鑒定

彭武建，王紅蕾，黃建溶，戴勇（.深圳市第三人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東 深圳 58000；.南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東廣州 50000；.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 深圳市人民醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 深圳 5800）

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類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者循環(huán)microRNAs生物標(biāo)志物的篩選及鑒定

彭武建1，王紅蕾2，黃建溶1，戴勇3
（1.深圳市第三人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東 深圳 518000；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 腎內(nèi)科，廣東廣州 510000；3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 深圳市人民醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 深圳 518020）

［摘 要］目的：分析類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者血漿中差異表達(dá)的microRNAs（miRNAs）。方法：采用miRNA芯片檢測(cè)、篩選RA患者與正常人血漿中表達(dá)有顯著變化的miRNAs，并采用RT-qPCR技術(shù)對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。數(shù)據(jù)處理采用GeneSpring GX軟件，t檢驗(yàn)和方差分析用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：RA患者與正常人間存在差異的循環(huán)miRNAs共有40個(gè)，其中18個(gè)上調(diào)，22個(gè)下調(diào)。根據(jù)循環(huán)miRNAs在芯片中表達(dá)差異的倍數(shù)和潛在的生物學(xué)價(jià)值，選取4個(gè)miRNAs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，候選的miRNAs與正常對(duì)照間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證實(shí)芯片結(jié)果可靠性。結(jié)論：RA患者體內(nèi)具有差異表達(dá)的循環(huán)miRNAs，這些循環(huán)miRNAs可作為一種潛在的RA候選生物標(biāo)志物。

［關(guān)鍵詞］類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；微小RNA；芯片；生物標(biāo)志物

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以外周滑膜關(guān)節(jié)慢性炎性病變、關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)進(jìn)行性不可逆性破壞為特征的全身性自身免疫性疾病［1］。目前RA的診斷采用1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）修訂的診斷分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)［2］，符合此標(biāo)準(zhǔn)的患者常已出現(xiàn)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)破壞，不利于RA的早期診斷。因此，尋找RA特異性的疾病診斷生物標(biāo)志物尤為重要。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類(lèi)長(zhǎng)約18～25 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)［3］。miRNAs參與免疫功能調(diào)節(jié)過(guò)程及自身免疫性疾病的發(fā)生與進(jìn)展［4-6］。在循環(huán)系統(tǒng)中同樣可以檢測(cè)到miRNAs的存在，且血清/血漿中miRNAs在不同的疾病狀態(tài)下存在著差異表達(dá)，可作為一類(lèi)具有潛在價(jià)值的用于臨床的生物標(biāo)志物［7-8］。因此，本研究應(yīng)用miRNA基因芯片檢測(cè)RA患者與正常對(duì)照組的循環(huán)miRNAs表達(dá)譜，分析2組間差異表達(dá)miRNAs，進(jìn)行生物信息學(xué)分析及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究RA的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　對(duì)象和方法

1.1對(duì)象 收集深圳市人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科35例RA患者，其中男9例，女26例，年齡18～70歲，平均（44.9±11.5）歲。RA診斷符合1987年美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。RA組患者在接受大劑量糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒性藥物及免疫抑制劑治療前完成標(biāo)本采集。正常對(duì)照組選取30例排除了自身免疫系統(tǒng)疾病、肝腎功能正常的健康體檢者，其中男10例，女20例，年齡26～52歲，平均（42.9±8.7）歲。各組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具可比性。先每組取10例，進(jìn)行芯片初篩，余下病例作為RT-qPCR驗(yàn)證。研究計(jì)劃經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2標(biāo)本采集及總RNA的抽提和質(zhì)檢 EDTA抗凝管采集新鮮血液，在4 h內(nèi)以2 000×g離心10 min，吸取上層血漿于凍存管中，-80 ℃凍存。按mirVana PARIS試劑盒（Ambion）說(shuō)明書(shū)從600 μL的血漿中抽提總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量A260/A280值，測(cè)定濃度。

1.3混合樣本池法檢測(cè)循環(huán)miRNAs 按照等量混合的原則，每組10個(gè)樣品各取10 ng混合到成100 ng，進(jìn)行芯片檢測(cè)。

1.4樣品標(biāo)記及雜交 本實(shí)驗(yàn)所用Agilent Human miRNAs microarray Rel 12.0（上海伯豪生物有限公司）涵蓋886個(gè)人類(lèi)相關(guān)miRNAs以及89個(gè)人類(lèi)病毒相關(guān)miRNAs。100 ng總RNA經(jīng)Cy3熒光基團(tuán)標(biāo)記及干燥處理后與芯片雜交20 h（55 ℃，20 r/min）。然后進(jìn)行芯片洗滌、掃描。

1.5芯片圖像采集和數(shù)據(jù)分析 Agilent Feature Extraction（FE）software version 9.5.3軟件提取數(shù)據(jù)。應(yīng)用GeneSpring GX軟件，以Fold change ≥2，P≤0.05標(biāo)準(zhǔn)，篩選RA患者與正常人血漿中差異表達(dá)miRNAs。Fold Change指的是將2組數(shù)據(jù)均一化后，用信號(hào)值直接計(jì)算其差異的倍數(shù)。應(yīng)用TargetScan、microRNA.org、PITA數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及GO和KEGG分析。

1.6RT-qPCR驗(yàn)證 應(yīng)用RT-qPCR對(duì)4個(gè)顯著性差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行檢測(cè)。引物序列如下：miR-16：5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATATT-3’；miR-155： 5’-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGATA-3’；miR-223：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAATAC-3’；miR-451：5’-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTACTG-3’；Cel-lin4：5’-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCTCA AGTG-3’。反應(yīng)體系：5.0 μL cDNA（1∶20），10 μL 2x SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO），1.0 μL的引物補(bǔ)充RNase-free水至20 μL，以Cel-lin4為內(nèi)參，利用RT-qPCR儀（ABI PRISM 7 500 Sequence Detection System，ABI USA）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)反應(yīng)95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)值［9］。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，2組間比較使用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1循環(huán)miRNAs在RA患者血漿中的表達(dá) 采用miRNA芯片實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在RA患者和正常人血漿中存在著差異表達(dá)的miRNAs共有40個(gè)，其中18個(gè)上調(diào)，22個(gè)下調(diào)（見(jiàn)表1）?；谀壳暗难芯浚鶕?jù)芯片結(jié)果和miRNAs潛在的價(jià)值選取4個(gè)miRNAs進(jìn)行第二階段的驗(yàn)證。

表1　RA患者與正常對(duì)照間血漿差異表達(dá)的miRNAs

2.2RT-qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNAs 采用RT-qPCR檢測(cè)miR-16、miR-451、miR-223、miR-155在RA患者與正常人血漿中的表達(dá)情況（見(jiàn)圖1），其中miR-16、 miR-451和miR-223在RA患者血漿中表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），而miR-155卻低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。

圖1 循環(huán)miRNAs RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果

2.3生物信息學(xué)結(jié)果 為了研究miRNAs的生物學(xué)功能，用Target Scan Human Custom（http∶//www. targetsan.org）分別對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行Pathway分析，以P＜0.01，至少2個(gè)基因存在于該信號(hào)傳導(dǎo)通路為限制條件，尋找相關(guān)信號(hào)通路，主要有：癌癥相關(guān)通路、調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架通路、泛素介導(dǎo)的蛋白降解通路以及趨化因子信號(hào)通路等（見(jiàn)表2）［10］。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)利用芯片檢測(cè)結(jié)合生物信息學(xué)方法，篩選了RA患者與正常人血漿中差異表達(dá)的40個(gè)miRNAs。通過(guò)對(duì)這些差異表達(dá)的循環(huán)miRNAs及可能靶基因進(jìn)行功能分類(lèi)，進(jìn)一步推測(cè)其對(duì)RA的診斷和治療潛在的意義。發(fā)現(xiàn)在RA患者和正常人血漿中存在著差異表達(dá)的miRNAs共有40個(gè)，其中18個(gè)上調(diào)，22個(gè)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中大部分miRNAs表達(dá)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道相符，但有部分miRNAs，如miRNA-146a在本研究中未見(jiàn)表達(dá)差異。這可能與芯片敏感性可能是試驗(yàn)誤差有關(guān)，故需要進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。根據(jù)芯片中miRNAs的表達(dá)倍數(shù)和miRNAs潛在表達(dá)意義，本實(shí)驗(yàn)選擇了4個(gè)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，其中miR-16、miR-451和miR-223在RA患者血漿中的相對(duì)表達(dá)上調(diào)，而miR-155表達(dá)下調(diào)。候選循環(huán)miRNAs驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果一致，證明了芯片結(jié)果的可靠性。

表2　KEGG信號(hào)通路表

目前發(fā)現(xiàn)miR-451在腫瘤患者中可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和凋亡。研究表明，miR-451抑制通過(guò)p38 MAPK抑制中性粒細(xì)胞的趨化性，是RA的潛在治療靶點(diǎn)［12］。然而該研究中RA患者的中性粒細(xì)胞中miR-451低表達(dá)，而本研究顯示循環(huán)miR-451高表達(dá)不符合，原因尚有待進(jìn)一步明確。miR-16家族在特定環(huán)境中可通過(guò)調(diào)控cyclin D及CDK等細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯［13］。敲除內(nèi)源性的miR-16可顯著延長(zhǎng)TNF-α mRNA的半衰期［14］。miR-16與RA成纖維細(xì)胞增殖及滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［11］。miR-155被證實(shí)參與炎癥、免疫和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展多種生理病理過(guò)程。miR-155抑制間質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1、MMP-1的生成，緩解關(guān)節(jié)組織破壞。miR-155在RA患者滑液中表達(dá)水平升高，通過(guò)減少Toll受體配體MMP-3和細(xì)胞因子表達(dá)來(lái)達(dá)到控制慢性炎癥、減少滑膜組織損害的作用［15-16］。此外，miR-155參與免疫反應(yīng)，在調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的活化、增殖和分化，淋巴細(xì)胞發(fā)育，T、B細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮作用［17］。miR-155的異常表達(dá)可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞功能紊亂，發(fā)生自身免疫性疾病。RA患者滑膜組織中的miR-155高表達(dá)，它在滑膜組織中控制破骨細(xì)胞的分化，提示參與滑膜炎及骨質(zhì)破壞［18］。miR-223也在造血干細(xì)胞的分化、粒細(xì)胞的分化激活中起著至關(guān)重要的作用［19］。有研究表明，miR-223參與腎移植后急性排斥反應(yīng)［20］。本研究顯示，RA患者中，其血漿循環(huán)miR-16、miR-45、miR-223、miR-155的表達(dá)水平顯著差異，它們的表達(dá)異常與RA是密切相關(guān)的，盡管具體作用機(jī)制尚不完全明確，但有可能成為RA診斷的分子標(biāo)志物及治療靶標(biāo)。

本研究同時(shí)對(duì)靶基因進(jìn)行了GO分析和Pathway分析，提示RA發(fā)生發(fā)展是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到多種信號(hào)通路，對(duì)任一通路的調(diào)控都可能對(duì)治療RA起到重要作用。本研究獲得的差異表達(dá)miRNAs的靶基因信號(hào)通路分析顯示集中在癌癥相關(guān)通路、調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架通路、泛素介導(dǎo)的蛋白降解通路以及趨化因子信號(hào)通路等。如Focal adhesion信號(hào)通路與RA相關(guān)［21］，該信號(hào)通路與黏著斑有關(guān)。黏著斑是將細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架聯(lián)系起來(lái)的多蛋白聚集體，能進(jìn)行信號(hào)傳遞，引發(fā)相應(yīng)的生理、病理反應(yīng)。黏著斑激酶與黏著斑結(jié)合，在整合素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，它與骨代謝、成纖維細(xì)胞的擴(kuò)增及關(guān)節(jié)血管翳的生成有關(guān)［22］。

綜上所述，本研究篩選并驗(yàn)證了RA患者差異表達(dá)的循環(huán)miRNAs，為進(jìn)一步研究miRNAs在RA發(fā)病機(jī)制中的作用及尋找RA特異性診斷生物標(biāo)志物打下了基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)采用早期芯片，許多新的miRNAs未包含在內(nèi)。此外，樣本數(shù)量有限，仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，監(jiān)測(cè)miRNAs在健康人群、RA患者血清的表達(dá)來(lái)研究驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性。

參考文獻(xiàn)：

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì). 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南［J］. 中國(guó)風(fēng)濕病學(xué)雜志，2010，14（4）： 265-270.

［2］ARNETT F C，EDWORTHY S M，BLOCH D A，et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis［J］. Arthritis Rheum，1988，31（3）: 315-324.

［3］WANG Y，STRICKER H M，GOU D，et al. MicroRNA: past and present［J］. Front Biosci，2007，12:（6）: 2316-2329.

［4］SIMPSON L J，ANSEL K M. MicroRNA regulation of lymphocyte tolerance and autoimmunity［J］. J Clin Invest，2015，125（6）: 2242-2249.

［5］STYPINSKA B，PARADOWSKA-GORYCKA A. Cytokines and microRNAs as candidate biomarkers for systemic lupus erythematosus［J］. Int J Mol Sci，2015，16（10）: 24194-24218

［6］陳芳，陳朝生，章慧娣，等. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血B淋巴細(xì)胞中狼瘡活動(dòng)相關(guān)miRNA的篩選［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，43（2）： 106-111.

［7］MACHADO M T，NAVEGA S，DIAS F，et al. MicroRNAs for peripheral blood fraction identification: Origin，pathways and forensic relevance［J］. Life Sci，2015，15（143）: 98-104.

［8］DAI R，AHMED S A. MicroRNA，a new paradigm for understanding immunoregulation，inflammation，and autoimmune diseases［J］. Transl Res，2011，157（4）: 163-179.

［9］SILVER N，BEST S，JIANG J，et al. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR［J］. BMC Mol Biol，2006，7: 33.

［10］HUANG DA W，SHERMAN B T，LEMPICKI R A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists［J］. Nucleic Acids Res，2009，37（1）: 1-13.

［11］馮知濤，李娟，任潔，等. 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血miR-146a及miR-16的表達(dá)及與病情活動(dòng)的相關(guān)性研究［J］. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（2）： 320-323.

［12］MURATA K，YOSHIYOMI H，F(xiàn)URU M，et al. MicroRNA-451 down-regulates neutrophil chemotaxis via p38 MAPK ［J］. Arthritis Rheumatol，2014，66（3）: 549-559.

［13］LIU Q，F(xiàn)U H，SUN F，et al. miR-16 family induces cell cycle arrest by regulating multiple cell cycle genes［J］. Nucleic Acids Res，2008，36（16）: 5391-5404.

［14］JING Q，HUANG S，GUTH S，et al. Involvement of microRNA in AU-rich element-mediated miRNA instability［J］. Cell，2005，120（5）: 623-634.

［15］STANCZYK J，PEDRIOLI D M，BRENTANO F，et al. Altered expression of MicroRNA in synovial fibroblasts and synovial tissue in rheumatoid arthritis［J］. Arthritis Rheum，2008，58（4）: 1001-1009

［16］LIU F，F(xiàn)AN H，REN D，et al. TLR9-induced miR-155 and Ets-1 decrease expression of CD1d on B cells in SLE［J］. Eur J Immunol，2015，45（7）: 1934-1945.

［17］XIAO B，LIU Z，LI B S，et al. Induction of microRNA-155 during Helicobacter pylori infection and its negative regulatory role in the inflammatory response［J］. J Infect Dis，2009，200（6）: 916-925.

［18］SUN W，SHEN W，YANG S，et al. MiR-223 and miR-142 attenuate hematopoietic cell proliferation，and miR-223 positively regulates miR-142 through LMO2 isoforms and CEBP-β［J］. Cell Res，2010，20（10）: 1158-1269.

［19］FILKOVO M，ARADI B，SENOLT L，et al. Association of circulating miR-223 and miR-16 with disease activity in patients with early rheumatoid arthritis［J］. Ann Rheum Dis，2014，73（10）: 1898-1904.

［20］劉小友，徐健. Micro-RNA-223參與腎移植后急性排斥反應(yīng)中的作用［J］. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（10）：1121-1123.

［21］ATHERTON P，STUTCHBURY B，JETHWA D，et al. Mechanosensitive components of integrin adhesions: Role of vinculin［J］. Exp Cell Res，2015，S0014-4827（15）: 30160-30169.

［22］ZHANG M M，JIANG Y S，LV H C，et al Pathway-based association analysis of two genome-wide screening data identifies rheumatoid arthritis-related pathways［J］. Genes Immun，2014，15（7）: 487-494.

（本文編輯：吳健敏）

Screening and verification of circulating miRNA biomarkers of rheumatoid arthritis

PENG Wujian1，WANG Honglei2，HUANG Jianrong1，DAI Yong3. 1. Department of Nephrology，the Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen，518020； 2.Department of Nephrology，the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University，Guangzhou，510000； 3.Clinical Medical Research Center of the Second Clinical Medical College ，Shenzhen People’s Hospital，Jinan University，Shenzhen，518020

Abstract:Objective: To analyze the differentl expression of circulating microRNAs （miRNAs） in patients with rheumatoid arthritis （RA）. Methods: MiRNA profiles were performed to determine the differentially expressed miRNAs using RNA obtained from the plasma of patients with RA and healthy controls； to confirm array results，RT-qPCR was used for validation. GeneSpring GX software was to data processing，t-test and one way ANOVA were used for statistical analysis. Results: The array analysis identified 40 （18 upregulated miRNAs and 22 downregulated miRNAs） circulating miRNAs significantly differently expressed between RA and healthy controls，then we detected the candidate miRNAs selected based on fold-change and potential value by RT-qPCR，consistented with the data obtained from the array，the circulating level of candidate miRNAs were significantly differed in patients with RA compared with healthy controls （P＜0.05）. Conclusion: Differently expressed circulating miRNAs can be detected in patients with RA，this study indicates that circulating miRNAs may be used as a potential candidate biomarker of RA.

Key words:rheumatoid arthritis； microRNAs； array； biomarker

作者簡(jiǎn)介：彭武建（1976-），男，湖南永順人，主治醫(yī)師，博士。

基金項(xiàng)目：深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研基金資助項(xiàng)目（201402033）。

收稿日期：2016-01-22

［中圖分類(lèi)號(hào)］R593.22

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.005