Maresin 1通過調(diào)控miR-340增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能

謝海青，張俊麗，謝翔，金勝威（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

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Maresin 1通過調(diào)控miR-340增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能

謝海青，張俊麗，謝翔，金勝威
（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

［摘 要］目的：研究促消退介質(zhì)Maresin 1（MaR1）在膿毒癥模型中促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能的機(jī)制。方法：通過檢測F4/80表達(dá)情況評估小鼠原代巨噬細(xì)胞純度。體內(nèi)外膿毒癥模型驗證脂多糖（LPS）和/或MaR1對miR-340表達(dá)的影響。骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340模擬物（mimic）或抑制劑（inhibitor）后，qRT-PCR檢測miR-340的表達(dá)量，評估轉(zhuǎn)染效率。熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測小鼠原代巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimic后巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球能力的變化。最后收集臨床樣本檢測膿毒癥患者血漿中miR-340的表達(dá)與健康志愿者的區(qū)別。結(jié)果：經(jīng)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀鑒定小鼠原代巨噬細(xì)胞純度達(dá)90%以上。體內(nèi)外膿毒癥模型均顯示miR-340的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。膿毒癥患者與健康志愿者相比血液中miR-340的表達(dá)也顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測小鼠原代巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimic后，巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的能力降低（P＜0.05）。在體內(nèi)外膿毒癥模型中，MaR1均明顯降低miR-340的表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)論：MaR1通過抑制miR-340的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，在膿毒癥病理生理過程中發(fā)揮抗炎促消退作用。

［關(guān)鍵詞］Maresin 1；脂多糖；miR-340；膿毒癥；巨噬細(xì)胞；吞噬作用；小鼠

膿毒癥是感染引起的有害的復(fù)雜臨床綜合征［1］，以系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）和菌血癥為特征，嚴(yán)重者可發(fā)展至多器官衰竭，甚至死亡［2］。臨床治療膿毒癥的方法主要為抗炎，常使用高劑量糖皮質(zhì)激素［3］、白介素-1受體拮抗劑［4］、Toll樣受體拮抗劑［5］等。然而這些方法并不能降低膿毒癥的病死率。近年越來越多的研究者認(rèn)為膿毒癥后期處于免疫抑制狀態(tài)，并提出促炎癥消退新策略—提高自身免疫，促進(jìn)炎癥消退。證據(jù)顯示炎癥消退是一個主動的調(diào)節(jié)過程，依賴機(jī)體產(chǎn)生一系列的內(nèi)源性抗炎促消退介質(zhì)（specialized pro-resolving mediators，SPMs），及時減少和限制組織過度損傷，促進(jìn)炎癥消退，恢復(fù)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)［6］。Maresin 1（MaR1）系最近發(fā)現(xiàn)的促炎癥消退新介質(zhì)［7］，能減輕酵母多糖誘導(dǎo)的腹膜炎［7］，抑制中性粒細(xì)胞浸潤，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，具有強(qiáng)大的抗炎促消退作用［8］。本研究主要探討MaR1促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能的具體機(jī)制。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗動物 SPF級健康C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量18～25 g，來自上海SLAC實(shí)驗動物公司（動物合格證號：XI304239，已通過動物實(shí)驗倫理學(xué)批準(zhǔn)），飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心。所有進(jìn)入實(shí)驗室的人、動物均需經(jīng)嚴(yán)格的微生物控制，所有飼料、水、鋪墊物等所需物均經(jīng)高溫滅菌處理。

1.2實(shí)驗試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；巰基乙酸肉湯、臺盼藍(lán)、EDTA· 2Na、大腸桿菌脂多糖（LPS，055：B5）、熒光微球（L3030）購自Sigma公司；MaR1購自Cayman公司；巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）由R&D公司提供；所有micro-RNA相關(guān)試劑均來自廣州市銳博生物科技有限公司；APC anti-Mouse F4/80抗體、Cell stain buffer購自BioLegend公司。

1.3小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離 提前5 d向小鼠腹腔注入3%巰基乙酸肉湯，當(dāng)天脫頸處死小鼠，暴露腹膜，向腹腔內(nèi)注入5 mL 3% FBS-PBS，充分按摩小鼠腹部，抽取腹腔液，離心棄上清液，加入10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)基重懸；用0.4%臺盼藍(lán)染色，當(dāng)活細(xì)胞數(shù)達(dá)到95%以上時調(diào)整細(xì)胞濃度2×106cells/mL，接板，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；1 h后，棄培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞，加入10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，次日用于實(shí)驗。

1.4小鼠骨髓巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗當(dāng)天脫頸處死小鼠，暴露后肢皮膚，分離出完整的股骨和脛骨，移至超凈臺；用剪刀剪斷股骨和脛骨的兩端，用PBS進(jìn)行骨髓腔灌洗，收集灌洗液；離心棄上清液，加入紅細(xì)胞裂解液，靜置5 min；離心棄上清液，用含有M-CSF（濃度為20 ng/mL）的10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)基重懸，計數(shù)調(diào)整為4×106cells/mL，接75 cm2培養(yǎng)瓶，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中；第3天更換含有M-CSF的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；第5天棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入提前預(yù)熱的5 mmol/L EDTA-PBS消化10 min，再用細(xì)胞刮刀消化細(xì)胞并收集；4 ℃離心棄上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸；0.4%臺盼藍(lán)染色計數(shù)接板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日用于實(shí)驗。

1.5小鼠盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）模型的建立及樣本收集

1.5.1中度CLP模型建立：腹腔注射戊巴比妥鈉（80 mg/kg）并監(jiān)測麻醉深度；對腹部皮膚進(jìn)行備皮及消毒；沿腹中線作正中切口，暴露腹白線并剪開腹膜，找到盲腸置于小鼠腹部左側(cè)；在盲腸基底部和游離端中間處結(jié)扎；將盲腸內(nèi)容物向遠(yuǎn)端輕輕擠壓，于結(jié)扎處和游離端中間用21 G穿刺針從腸系膜側(cè)刺向游離側(cè)；拔出穿刺針后，擠壓盲腸，見腸內(nèi)容物從腸系膜側(cè)孔和游離側(cè)孔處擠出；將盲腸放回腹腔內(nèi)，連續(xù)縫合腹膜，間斷縫合皮膚；皮下注射氯化鈉注射液（50 mL/kg）進(jìn)行補(bǔ)液，在保溫毯內(nèi)進(jìn)行復(fù)蘇，每6 h觀察動物的情況和存活率，24 h收集樣本。

1.5.2實(shí)驗分組：①假手術(shù)（Sham）組：暴露盲腸后，不結(jié)扎不穿刺，將其放回，縫合腹膜及皮膚。②中度膿毒癥（CLP）組：參照1.5.1步驟建立CLP模型。③中度膿毒癥治療（CLP+MaR1）組：CLP模型造好后15 min，腹腔注射MaR1（每只小鼠注射100 ng MaR1）。

1.5.3收集樣本：24 h后存活的小鼠用戊巴比妥鈉（80 mg/kg）進(jìn)行麻醉，腹腔注射肝素（100 U/100 g），固定在操作臺上，剪開頸部皮膚，分離肌肉和筋膜，暴露頸動脈，剪破頸動脈，并用注射器收集血液于離心管中。4 ℃離心5 min，吸取上清液，即血漿，-80 ℃保存待用。

1.6臨床樣本的選擇及處理

1.6.1研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)：選取2015年3月至9月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室、溫州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室、瑞安市人民醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室住院治療的膿毒癥患者8例為膿毒癥組，年齡25～75歲，均符合美國重癥醫(yī)學(xué)會（SCCM）聯(lián)合歐洲危重病醫(yī)學(xué)會（ESICM）2012年提出的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取同期門診健康體檢者5例為健康志愿組，年齡25～75歲，2周內(nèi)未服用任何藥物。

本研究符合赫爾辛基宣言并通過溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批，同時所有患者和健康志愿者均簽署知情同意書。

1.6.2排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合入選標(biāo)準(zhǔn)；懷孕或哺乳期婦女；長期使用抗凝藥物者；長期服用免疫抑制藥物或長期處于免疫抑制狀態(tài)，如HIV陽性患者；嚴(yán)重心律失?；颊?。

1.6.3剔除標(biāo)準(zhǔn)：納入后不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)者；有其他干擾因素影響數(shù)據(jù)真實(shí)性者。

1.6.4樣本收集及處理：膿毒癥患者入選后在達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)24 h內(nèi)，應(yīng)用抗生素前，取2 mL新鮮外周血于去酶抗凝管中，4 ℃離心5 min，吸取上清液，即血漿，-80 ℃保存待用。

1.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù) 按照riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑使用說明對腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓巨噬細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率，選擇最佳轉(zhuǎn)染劑量和時間。

1.8細(xì)胞免疫熒光技術(shù) 取出細(xì)胞后PBS清洗3遍，加入4%多聚甲醛-PBS固定液，4 ℃固定30 min；PBS沖洗后加入相應(yīng)抗體，4 ℃避光染色30 min；再次進(jìn)行PBS清洗，加入DAPI，室溫避光染色10 min即可。熒光顯微鏡下觀察，拍片，計數(shù)。

1.9流式細(xì)胞技術(shù) ①設(shè)門：首先設(shè)立FSC-A/ FSC-H二維散點(diǎn)圖，選定細(xì)胞群P1，最大限度地排除細(xì)胞碎片；FSC-A/SSC-A二維散點(diǎn)圖中調(diào)節(jié)FSC和SSC電壓值，在P1門中圈出細(xì)胞群P2，即為目標(biāo)細(xì)胞。②獲取結(jié)果：在目標(biāo)熒光通路上檢測樣本的熒光強(qiáng)度。每份樣本檢測10 000個細(xì)胞，數(shù)據(jù)可用直

1.11統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)都以±s來表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，兩兩比較采用Newman-keuls檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。方圖或二維散點(diǎn)圖表示。所有數(shù)據(jù)用CytExpert或FlowJo 7.6軟件進(jìn)行處理分析。

1.10PCR技術(shù) ①引物序列：miR-340上游引物5’-GCGCTAGGTAGTTTCCTGTT-3’，下游引物5’-GTGCAGGGTC CGAGGT-3’。②反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min進(jìn)入循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ l min，40個循環(huán)；進(jìn)入融解曲線階段，60 ℃ l min，95 ℃ 15 s。③結(jié)果分析：將PCR得到的目的基因CT值與其對應(yīng)的內(nèi)參CT值相減進(jìn)行第1次校正，得到目的基因的校正CT值（?CT），再以對照組中的?CT作為本底參數(shù)進(jìn)行第2次校正，則目的基因的量為：2-??CT。④每次實(shí)驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值；每次擴(kuò)增的同時設(shè)置無cDNA的陰性對照，當(dāng)陰性對照的CT值小于35時，該次擴(kuò)增數(shù)據(jù)棄去。

2　結(jié)果

2.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓巨噬細(xì)胞純度鑒定

2.1.1熒光顯微鏡法：結(jié)果顯示小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（見圖1A-C）和骨髓巨噬細(xì)胞（見圖1D-F）占所有細(xì)胞的90%以上，可用于實(shí)驗。

圖1　熒光顯微鏡鑒定小鼠原代巨噬細(xì)胞（×200）

2.1.2流式細(xì)胞術(shù)法：結(jié)果顯示骨髓巨噬細(xì)胞占所有細(xì)胞95%以上，可用于實(shí)驗（見圖2）。

2.2膿毒癥模型miR-340表達(dá)增高，而MaR1能抑制miR-340的誘導(dǎo)表達(dá)

圖2　流式細(xì)胞術(shù)鑒定小鼠骨髓巨噬細(xì)胞純度

2.2.1在體實(shí)驗：不同處理后收集血漿樣本，檢測miR-340表達(dá)情況（n=6）。與Sham組比較，CLP組miR-340表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與CLP組比較，CLP+ MaR1組miR-340表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖3A。

2.2.2體外實(shí)驗：不同處理后收集細(xì)胞樣本，檢測miR-340表達(dá)量（n=7）。與control組相比，LPS 組miR-340表達(dá)升高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+MaR1組miR-340表達(dá)降低（P＜0.05），見圖3B。

2.3小鼠骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimic可增強(qiáng)miR-340的表達(dá)

2.3.1轉(zhuǎn)染mimic實(shí)驗：骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimic后收集樣本，檢測miR-340表達(dá)情況（n= 6）。選取最佳轉(zhuǎn)染劑量50 nmol/L（P＜0.05）和最佳轉(zhuǎn)染時間48 h（P＜0.05），見圖4。

2.3.2轉(zhuǎn)染inhibitor實(shí)驗：骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 inhibitor后收集樣本，檢測miR-340表達(dá)情況（n=6）。結(jié)果顯示miR-340的表達(dá)量并沒有顯著下降（P＞0.05），見圖5。

2.4腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimic后，巨噬細(xì)胞吞噬能力下降

2.4.1熒光顯微鏡法：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimic后收集樣本，用吞噬率或吞噬指數(shù)表示巨噬細(xì)胞吞噬能力。結(jié)果顯示miR-340能降低巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)（P＜0.05），見圖6。

2.4.2流式細(xì)胞術(shù)法：小鼠骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimic后收集樣本，用吞噬率或平均熒光強(qiáng)度表示巨噬細(xì)胞吞噬能力。

圖3　膿毒癥模型miR-340表達(dá)增高，而MaR1能降低miR-340的表達(dá)

圖4　小鼠骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimic的量效（A）與時效（B）

圖5 小鼠骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 inhibitor量效

FSC-A/FSC-H二維散點(diǎn)圖，選定細(xì)胞群P1（見圖7A）；FSC-A/SSC-A二維散點(diǎn)圖，圈出細(xì)胞群P2（見圖7B）；在熒光微球發(fā)射光的熒光通路（ECD）上檢測樣本的熒光強(qiáng)度，首先測定微球樣本，確定單個熒光微球在ECD-A/Count直方圖上的位置，即熒光強(qiáng)度（見圖7C），再檢測巨噬細(xì)胞樣本。數(shù)據(jù)可用直方圖（見圖7D）或二維散點(diǎn)圖（見圖7E）表示。結(jié)果顯示miR-340能降低巨噬細(xì)胞的吞噬率和平均熒光強(qiáng)度（P＜0.05），見圖7F-G。多樣本直方圖能直觀顯示出該結(jié)果（見圖7H）。

2.5臨床樣本血漿檢測，膿毒癥患者miR-340表達(dá)增強(qiáng) 膿毒癥患者入住重癥監(jiān)護(hù)室（接受治療前，尤其是抗生素治療）收集外周血樣本，檢測miR-340表達(dá)量（n=6）。結(jié)果顯示，與健康志愿者相比，膿毒癥患者的miR-340表達(dá)升高（P＜0.05），見圖8。

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)MaR1在CLP和LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型中通過調(diào)節(jié)miR-340發(fā)揮對巨噬細(xì)胞吞噬功能的調(diào)控作用。在體實(shí)驗（小鼠CLP模型）和體外實(shí)驗（LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞膿毒癥模型）證實(shí)膿毒癥miR-340的表達(dá)量明顯增加，MaR1可以降低其表達(dá)；而且臨床膿毒癥患者血漿miR-340的水平也較健康志愿者明顯增高。同時，對小鼠原代巨噬細(xì)胞進(jìn)行miR-340 mimic轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果均顯示miR-340能抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能。以往研究表明膿毒癥患者巨噬細(xì)胞功能受到抑制［9］，而MaR1能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能［7］。因此我們認(rèn)為膿毒癥通過誘導(dǎo)miR-340的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能，進(jìn)而引起膿毒癥的一系列病理生理改變，而MaR1可以逆轉(zhuǎn)這個過程，故我們認(rèn)為MaR1對膿毒癥的治療及預(yù)后有一定的臨床意義。

膿毒癥的發(fā)病機(jī)制涉及病原微生物與宿主免疫、炎癥和凝血反應(yīng)之間復(fù)雜的相互作用［10］。在膿毒癥的早期階段，產(chǎn)生過量的促炎介質(zhì)，如TNF-α和IL-1β，引起自身損傷和多器官功能障礙。一直以來我們的治療策略為抗炎，但膿毒癥的病死率仍居高不下使得我們不得不反思膿毒癥的發(fā)生機(jī)制到底是什么。目前的觀點(diǎn)是機(jī)體產(chǎn)生代償性的抗炎反應(yīng)來對抗過度的炎癥反應(yīng)，構(gòu)成了膿毒癥的晚期階段—免疫抑制［1］。而在免疫抑制階段中最重要的就是單核-巨噬細(xì)胞的功能受到抑制。有研究證實(shí)對免疫抑制狀態(tài)的膿毒癥患者使用干擾素-γ，可增強(qiáng)單核細(xì)胞的免疫功能，提高膿毒癥患者的生存率［11］。

圖6　熒光顯微鏡下檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球能力（×200）

Maresin是DHA經(jīng)人巨噬細(xì)胞上12-LOX合成的脂質(zhì)介質(zhì)家族，在組織穩(wěn)態(tài)、炎癥消退、傷口愈合和機(jī)體防御方面具有重要作用。MaR1是該家族的第一位成員，與其他omega-3脂肪酸來源的介質(zhì)（如保護(hù)素D1和消退素E1）相比，具有顯著的抗炎特性，如在酵母多糖誘導(dǎo)的腹膜炎模型中調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞浸潤和巨噬細(xì)胞吞噬功能［7］。MaR1還能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化促進(jìn)炎癥消退［12］。越來越多的文獻(xiàn)報道MaR1在各種疾病進(jìn)程中的治療作用，如能通過抑制中性粒細(xì)胞的黏附和減少促炎因子的釋放減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷［13］，又能通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）改善博來霉素引起的肺纖維化［14］，以及減輕四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷［15］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MaR1能降低小鼠中度CLP模型的24 h死亡率，對膿毒癥的預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。因此MaR1有望應(yīng)用于臨床，成為治療膿毒癥的有效藥物。

MiRNAs是小的非編碼單鏈RNA，通過與靶mRNA 3’UTR完全或不完全配對，抑制靶mRNA的翻譯或者直接將其降解，于轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因的蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。人類生物信息學(xué)預(yù)測miRNAs的靶基因非常廣泛，可以調(diào)控人類基因的30%以上，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，如細(xì)胞周期、凋亡、造血干細(xì)胞分化、新陳代謝及腫瘤轉(zhuǎn)移［16］。分析各類疾病及其不同病程中miRNAs的表達(dá)量，結(jié)果顯示在不同疾病或同種疾病的不同進(jìn)程中，miRNAs表達(dá)量是有變化的，其中有顯著變化的miRNAs可能成為各種疾病診斷的生物學(xué)標(biāo)記物以及治療的靶點(diǎn)。已有研究證實(shí)miR-25、miR-146、miR-150、miR-133a和miR-223可能作為膿毒癥的生物標(biāo)記物［17］。我們的數(shù)據(jù)顯示膿毒癥miR-340的表達(dá)量顯著增高，證明miR-340也可作為膿毒癥的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)；而MaR1能降低體內(nèi)/體外膿毒癥模型中miR-340的誘導(dǎo)表達(dá)，說明MaR1可能通過調(diào)節(jié)miR-340的表達(dá)，改善膿毒癥的預(yù)后。

圖7　流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠骨髓巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球能力

大量文獻(xiàn)證實(shí)miR-340可作為多種腫瘤的抑制物，與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，也與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力、細(xì)胞骨架重建相關(guān)。惡性組織與正常/良性組織相比miR-340的表達(dá)受到抑制，而降低miR-340的水平可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，如miR-340能抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的生長［18］，而骨髓中miR-340的低表達(dá)與結(jié)腸直腸癌的肝轉(zhuǎn)移有關(guān)［19］。miR-340可直接抑制靶基因ROCK1的表達(dá)來抑制骨肉瘤的增長和轉(zhuǎn)移［20］，又可以抑制靶基因RhoA參與紫外輻射誘導(dǎo)的樹突形成［21］；而ROCK1是RhoA小GTP酶的重要下游效應(yīng)器，當(dāng)ROCK1選擇性結(jié)合Rho GTP活性形式時被激活，而激活的ROCK1與肌動蛋白細(xì)胞骨架相互作用以促進(jìn)肌動蛋白重組和細(xì)胞收縮［22］。因此我們推測miR-340能通過抑制RhoA/ROCK1的表達(dá)，抑制細(xì)胞的收縮，促進(jìn)細(xì)胞伸出偽足進(jìn)行吞噬。我們的結(jié)果顯示miR-340能抑制巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球，補(bǔ)充實(shí)驗卻證實(shí)miR-340并不影響巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌。這與巨噬細(xì)胞吞噬機(jī)制的復(fù)雜性密切相關(guān)。吞噬不同物質(zhì)時，顆粒的性質(zhì)不同，結(jié)合的受體各異，以及吞噬過程中啟動的信號通路也不盡相同［23］。巨噬細(xì)胞通過多病原相關(guān)分子模式（以Toll樣受體家族為成員）直接識別病原體，而對調(diào)理過的病原體則通過補(bǔ)體受體和Fc受體介導(dǎo)的識別模式。所以我們認(rèn)為miR-340可能只影響補(bǔ)體受體或Fc受體介導(dǎo)的信號通路，從而影響巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球。

圖8　膿毒癥患者血漿中miR-340表達(dá)明顯增加

最后，我們研究了增強(qiáng)miR-340的表達(dá)是否可以減弱MaR1對巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用。小鼠骨髓巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-340 mimic（50 nmol/L 48 h）后，加入LPS（1 μg/mL）和/或MaR1（100 nmol/L）8 h，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球能力的變化。結(jié)果顯示，miR-340并不能降低MaR1對巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用。我們認(rèn)為MaR1可以通過很多途徑增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，而對miR-340的調(diào)節(jié)只是其中的一條途徑，各種通路之間進(jìn)行交互作用，最終表現(xiàn)出整體效應(yīng)。

總之，MaR1可逆轉(zhuǎn)CLP/LPS誘導(dǎo)膿毒癥中巨噬細(xì)胞吞噬功能的抑制，其作用可能與調(diào)節(jié)miR-340的表達(dá)有關(guān)。MaR1有可能成為膿毒癥的有效治療藥物，而miR-340則可能成為膿毒癥的生物標(biāo)記物之一。

參考文獻(xiàn)：

［1］COHEN J. The immunopathogenesis of sepsis［J］. Nature，2002，420（6917）: 885-891.

［2］ANGUS D C，VANDER P T. Severe sepsis and septic shock ［J］. N Engl J Med，2013，369（21）: 2063.

［3］VANDENBERG J W，VANDERZEE M，DEBRUIN R W，et al. Mild versus strong anti-inflammatory therapy during early sepsis in mice: a matter of life and death［J］. Crit Care Med，2011，39（6）: 1275-1281.

［4］FISHER C J，DHAINAUT J F，OPAL S M，et al. Recombinant human interleukin 1 receptor antagonist in the treatment of patients with sepsis syndrome. Results from a randomized，double-blind，placebo-controlled trial. Phase III rhIL-1ra Sepsis Syndrome Study Group［J］. JAMA，1994，271（23）: 1836-1843.

［5］OPAL S M，LATERRE P F，F(xiàn)RANCOIS B，et al. Effect of eritoran，an antagonist of MD2-TLR4，on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial［J］. JAMA，2013，309（11）: 1154-1162.

［6］SERHAN C N. Resolution phase of inflammation: novel endogenous anti-inflammatory and proresolving lipid mediators and pathways［J］. Annu Rev Immunol，2007，25: 101-137.

［7］SERHAN C N，YANG R，MARTINOD K，et al. Maresins: novel macro-phage mediators with potent anti-inflammatory and proresolving actions［J］. J Exp Med，2009，206（1）: 15-23.

［8］SERHAN C N，DALLI J，KARAMNOV S，et al. Macrophage proresolving mediator maresin 1 stimulates tissue regeneration and controls pain［J］. FASEB J，2012，26 （4）: 1755-1765.

［9］DONNELLY L E，BARNES P J. Defective phagocytosis in air-ways disease［J］. Chest，2012，141 （4）: 1055-1062.

［10］RUSSELL J A. Management of sepsis［J］. N Engl J Med，2006，355（16）: 1699-1713.

［11］LOLIS E，BUCALA R. Therapeutic approaches to innate immunity: severe sepsis and septic shock［J］. Nat Rev Drug Discov，2003，2（8）: 635-645.

［12］DALLI J，ZHU M，VLASENKO N A，et al. The novel 13S，14S-epoxy-maresin is converted by human macrophages to maresin 1 （MaR1），inhibits leukotriene A4 hydrolase （LTA4H），and shifts macrophage phenotype［J］. FASEB J，2013，27（7）: 2573-2583.

［13］GONG J，WU Z Y，QI H，et al. Maresin 1 mitigates LPS-induced acute lung injury in mice［J］. Br J Pharmacol，2014，171（14）: 3539-3550.

［14］WANG Y，LI R，CHEN L，et al. Maresin 1 inhibits epithelialto-mesenchymal transition in vitro and attenuates bleomycin induced lung fibrosis in vivo［J］. Shock，2015，44（5）: 496-502.

［15］LI R，WANG Y，ZHAO E，et al. Maresin 1，a proresolving lipid mediator，mitigates carbon tetrachloride-induced liver injury in mice［J］. Oxid Med Cell Longev，2016，2016: 9203716.

［16］AMISL J，DEPONTUAL L，HENRION C A. miRNA，development and disease［J］. Adv Genet，2012，80: 1-36.

［17］BENZ F，ROY S，TRAUTWEIN C，et al. Circulating mi-

croRNAs as biomarkers for sepsis［J］. Int J Mol Sci，2016，17（1）: 299-307.

［18］SUN Y，ZHAO X，ZHOU Y，et al. miR-124，miR-137 and miR-340 regulate colorectal cancer growth via inhibition of the Warburg effect ［J］. Oncol Rep，2012，28 （4）: 1346-1352.

［19］TAKEYAMA H，YAMAMOTO H，YAMASHITA S，et al. Decreased miR-340 expression in bone marrow is associated with liver metastasis of colorectal cancer［J］. Mol Cancer Ther，2014，13 （4）: 976-985.

［20］ZHOU X，WEI M，WANG W. MicroRNA-340 suppresses osteosarcoma tumor growth and metastasis by directly targeting ROCK1［J］. Biochem Biophys Res Commun，2013，437（4）: 653-658.

［21］JIAN Q，AN Q，ZHU D，et al. MicroRNA 340 is involved in UVB-induced dendrite forma-tion through the regulation of RhoA expression in melanocytes［J］. Mol Cell Biol，2014，34（18）: 3407-3420.

［22］LI F，JIANG Q，SHI K J，et al. RhoA modulates functional and physical interaction between ROCK1 and Erk1/2 in selenite-induced apoptosis of leukaemia cells［J］. Cell Death Dis，2013，4: e708.

［23］ADEREM A，UNDERHILL D M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages［J］. Annu Rev Immunol，1999，17: 593-623.

（本文編輯：丁敏嬌）

Maresin 1 strengthen macrophages phagocytosis via miR-340

XIE Haiqing，ZHANG Junli，XIE Xiang，JIN Shengwei. Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325027

Abstract:Objective: To investigate whether Maresin 1 （MaR1） could strengthen macrophage phagocytosis in sepsis model，and to explore the underlying mechanisms. Methods: Mouse peritoneal macrophages and bone marrow-derived macrophages （BMDMs） were assessed through detection of F4/80 expression by fluorescence microscopy and flow cytometry. MiR-340 expression was investigated under the treatment of MaR1 in CLP-induced and LPS-induced sepsis model in vivo and in vitro. MiR-340 expression in BMDMs transfected with miR-340 mimic or inhibitor was detected by quantificational real-time polymerase chain reaction （qRTPCR）. And then，the effect of miR-340 on phagocytosis of macrophage was investigated with fluorescence microscopy and flow cytometry. Finally，miR-340 serum concentration in sepsis patients and in healthy volunteers was measured. Results: Mouse peritoneal macrophages and BMDMs were consisted of approximately 90% as assessed by F4/80 expression. MiR-340 expression was up-regulated in LPS challenging and down-regulated with MaR1 administration in vivo and in vitro （P＜0.05）. MiR-340 expression was up-regulated in BMDMs transfected with miR-340 mimic，however dose not down-regulated in BMDMs transfected with miR-340 inhibitor. The phagocytosis of mouse peritoneal macrophages transfected with miR-340 mimic was suppressed by fluorescence microscopy （P＜0.05）； Similarly，the function of BMDMs transfected with miR-340 mimic was refrained by flow cytometry （P＜0.05）. MiR-340 serum concentration was elevated in sepsis patients （P＜0.05）. Conclusion: MaR1 can strengthen macrophage phagocytosis via miR-340 in sepsis.

Key words:Maresin 1； LPS； miR-340； sepsis； macrophages； phagocytosis； mice

通信作者：金勝威，教授，博士生導(dǎo)師，Email：jinshengwei69@ 163.com。

作者簡介：謝海青（1991-），女，浙江溫州人，碩士生。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（81570076）。

收稿日期：2016-03-23

［中圖分類號］R4

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.001