鹿花盤粉對四氯化碳誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

黃彬彬　南璐璐　趙　越　陳思瑤　楊　柳　徐　峰　劉　磊　周　涌

(吉林醫(yī)藥學(xué)院護(hù)理學(xué)院，吉林　吉林　132013)

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鹿花盤粉對四氯化碳誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

黃彬彬南璐璐趙越陳思瑤1楊柳徐峰劉磊1周涌2

(吉林醫(yī)藥學(xué)院護(hù)理學(xué)院，吉林吉林132013)

〔摘要〕目的研究鹿花盤粉對四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法Wistar大鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對照組、CCl4模型組、陽性藥物組(聯(lián)苯雙酯50 mg/kg)、鹿花盤粉低(0.75 g/kg)、中(1.50 g/kg)和高(3.00 g/kg)劑量組，每組10只，連續(xù)灌胃給藥20 d。末次給藥12 h后,各組大鼠腹腔注射60%CCl4花生油，雌性4.00 ml/kg、雄性3.50 ml/kg，空白對照組給予等量花生油。24 h后處死大鼠，取肝組織蘇木素-伊紅(HE)染色觀察病理改變；取血液分光光度法測定血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性；取肝組織制備勻漿，測定其中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果與CCl4模型組比較，鹿花盤粉中劑量組大鼠血清ALT、AST活性明顯降低，肝臟組織中MDA含量明顯降低，GSH-PX活力明顯升高(P<0.05)；鹿花盤粉高劑量組肝臟組織中SOD活力較CCl4模型組明顯升高(P<0.05)。HE染色結(jié)果顯示，鹿花盤粉中劑量組肝內(nèi)病灶發(fā)生率下降，脂肪變性、壞死程度及炎性浸潤均明顯減輕。結(jié)論鹿花盤粉對CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕鹿花盤粉;四氯化碳;急性肝損傷;抗氧化

鹿花盤別名角盤、鹿角盤、珍珠盤、花盤〔1〕，是鹿科動物據(jù)茸后殘留的角根于第二年新茸萌發(fā)時脫落的部分，已知化學(xué)成分主要為蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、脂類及鈣、磷等礦物質(zhì)。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，鹿花盤具有強(qiáng)筋壯骨，溫補(bǔ)肝腎，活血消腫，治乳癰初起，陰癥瘡瘍等功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對鹿花盤藥理作用的研究主要集中在其抗氧化、治療乳腺增生、抗疲勞、抑菌、免疫作用及抗癌等方面〔2～8〕，但有關(guān)鹿花盤肝臟保護(hù)方面的研究少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討鹿花盤粉對大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物Wistar大鼠60只，雌雄各半，6～8周齡,體重(210±20)g，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，使用許可證號：SYXK(吉)2008/0010。

1.2儀器、材料和試劑722可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；TD5A臺式離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、DM1000顯微鏡(德國萊卡)；DP71圖像分析系統(tǒng)(日本奧林巴斯)。鹿花盤粉(購于吉林市龍?zhí)渡铰箞?；聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司)；四氯化碳(CCl4)(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3動物分組及模型建立將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為空白對照組、CCl4模型組、陽性藥物組和鹿花盤粉低、中、高劑量組，每組10只。陽性藥物組按50 mg/kg聯(lián)苯雙酯灌胃給藥，實(shí)驗(yàn)組分別按0.75 g/kg、1.50 g/kg和3.00 g/kg鹿花盤粉灌胃給藥,空白對照組和CCl4模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)20 d。末次給藥12 h后,除空白對照組外，各組大鼠分別腹腔注射60% CCl4花生油，雌性4.00 ml/kg、雄性3.50 ml/kg，空白對照組給予等量花生油。

1.4生化指標(biāo)檢測24 h后處死大鼠，腹主動脈取血，分離血清，按試劑盒說明檢測血清中ALT 和AST 活力；取肝臟組織于生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，加預(yù)冷生理鹽水于冰浴中制成10%勻漿，4℃離心(4 000 r/min，10 min)，分離上清，按試劑盒說明測定肝組織勻漿MDA含量和SOD、GSH-PX活力。

1.5肝臟病理切片制備取各組大鼠肝右葉相同位置肝組織，用預(yù)冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干，4%福爾馬林固定，脫水透明，石蠟包埋，切片，貼片，蘇木素-伊紅(HE)染色并封片，光鏡下(200倍)觀察各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化并拍照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析、最小顯著差數(shù)法(LSD)檢測。

2結(jié)果

2.1鹿花盤粉對CCl4所致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST 的影響CCl4模型組與空白對照組比較，血清ALT和AST活力顯著升高(P<0.01)，說明CCl4致大鼠急性肝損傷造模成功。與CCl4模型組比較，陽性藥物組和鹿花盤粉中劑量組血清ALT和AST活力均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2鹿花盤粉對CCl4致急性肝損傷大鼠肝臟MDA、SOD和GSH-PX的影響CCl4模型組與空白對照組比較，大鼠肝臟組織SOD和GSH-PX活力明顯下降，MDA含量明顯升高(P<0.01)，說明CCl4致大鼠急性肝損傷造模成功。陽性藥物組和鹿花盤粉中劑量組肝臟組織中MDA含量與CCl4模型組比較明顯降低(P<0.05)；陽性藥物組和鹿花盤粉高劑量組肝臟組織中SOD活力與CCl4模型組比較明顯升高(P<0.05)；陽性藥物組和鹿花盤粉中劑量組大鼠肝臟組織中GSH-PX活力與CCl4模型組比較顯著升高(P<0.01)。見表2。

表1各組血清ALT、AST水平比較(x±s,n=10,U/L)

組別ALTAST空白對照組22.1±5.361.8±7.5CCl4模型組118.3±28.52)237.0±20.82)陽性藥物組75.1±14.62)150.0±11.93)鹿花盤粉低劑量組93.8±15.5228.4±23.8鹿花盤粉中劑量組91.5±11.42)167.3±13.33)鹿花盤粉高劑量組110.6±29.8196.9±18.3

與空白對照組比較：1)P<0.01；與CCl4模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.3鹿花盤粉對CCl4致急性肝損傷大鼠肝臟病理改變的影響空白對照組大鼠肝小葉以中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝細(xì)胞索排列整齊,肝細(xì)胞呈多邊形,核大而圓,細(xì)胞分界清楚；CCl4模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞,肝實(shí)質(zhì)少量的纖維組織增生,匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞胞發(fā)生了脂肪變性，周邊區(qū)可見壞死細(xì)胞，肝靜脈淤血；陽性藥物組大鼠肝組織切片中肝細(xì)胞脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤均較CCl4模型組明顯減輕，且肝組織中無明顯纖維增生，提示聯(lián)苯雙酯對CCL4性肝損害有顯著的保護(hù)作用；鹿花盤粉中劑量組、情況較CCl4模型組有所改善，肝內(nèi)病灶發(fā)生率下降，脂肪變性、壞死程度及炎性浸潤均明顯減輕,僅見少量肝細(xì)胞變性和點(diǎn)狀壞死，肝小葉輪廓較清晰。鹿花盤粉末低劑量組和高劑量組情況較中劑量組效果不理想。綜上所述,鹿花盤粉中劑量組的效果優(yōu)于低劑量組和高劑量組,但不如陽性藥物組。見圖1。

表2鹿花盤粉對CCl4致急性肝損傷大鼠肝臟MDA、SOD和GSH-PX的影響(x±s,n=10)

組別MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)GSH-PX(U/mgprot)空白對照組1.14±0.19108.42±15.96283.96±30.86CCl4模型組1.82±0.261)80.36±8.831)151.93±23.91)陽性藥物組1.05±0.152)98.72±19.772)226.76±14.893)鹿花盤粉低劑量組1.71±0.2188.03±12.56186.46±16.14鹿花盤粉中劑量組1.13±0.182)83.36±14.06231.65±19.933)鹿花盤粉高劑量組1.42±0.1998.03±11.762)198.56±18.76

圖1　大鼠肝臟組織病理變化(HE，×200)

3討論

各種有害因素引起的肝損傷都會導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死或凋亡，而這又引發(fā)后續(xù)的炎癥和纖維化病變，表現(xiàn)為脂肪肝、肝纖維化、肝壞死、膽汁淤積、肝硬化及肝癌等嚴(yán)重威脅人類健康的病變〔9，10〕，因此目前對肝損傷的防治成為一個全球性的嚴(yán)峻課題。CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是最經(jīng)典的肝損傷模型，被廣泛應(yīng)用于肝損傷及再生的機(jī)制研究〔11，12〕。有研究發(fā)現(xiàn)，CCl4在體內(nèi)代謝生成CCl3·自由基,后者可與氧發(fā)生反應(yīng)生成CCl3OO·，此種自由基在體內(nèi)可通過兩種方式損傷細(xì)胞：一種為直接途徑,與膜蛋白或脂質(zhì)結(jié)合,尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng),造成烷化反應(yīng)以及酶的失活；另一種為間接途徑,通過與細(xì)胞膜及不飽和脂肪酸的相互作用從而增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)〔13〕。MDA是體內(nèi)自由基攻擊脂質(zhì)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物的代謝終產(chǎn)物〔14〕,是反映脂質(zhì)過氧化的敏感指標(biāo)，其含量的高低還可間接地反映肝損傷的程度〔15〕，脂質(zhì)過氧化物增多可使MDA含量升高。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)還可導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性損傷，使肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ALT、AST釋放入血，血清AST、ALT活性升高〔16〕。另一方面SOD和GSH-Px活性反映機(jī)體清除活性氧自由基的能力〔17，18〕。SOD可清除自由基，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的作用。GSH-PX可阻斷自由基對機(jī)體的進(jìn)一步損傷〔19〕。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生過多自由基時，引起抗氧化體系的耗竭及氧化物和抗氧化物的動態(tài)失衡，使SOD和GSH-PX水平下降〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示使用鹿花盤粉對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行干預(yù)后，可使急性肝損傷大鼠肝內(nèi)病灶發(fā)生率降低，脂肪變性、壞死程度及炎性浸潤均明顯減輕，提示鹿花盤粉對肝臟具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)。且有研究表明氨基酸及某些微量元素對肝臟有保護(hù)作用〔21〕，因鹿花盤中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和少量脂類,并含大量的鈣、磷及鋅、鐵、錳、鍶等微量元素〔1，22〕，故猜測鹿花盤粉中起肝保護(hù)作用的成分可能是蛋白質(zhì)和氨基酸，某些微量元素也可能對肝臟起到保護(hù)作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

1田玉華,胡薇.鹿花盤及其它鹿副產(chǎn)品的研究和開發(fā)利用〔J〕.時珍國醫(yī)國藥,2010;21(9)：2310-2.

2劉佳佳,張浩,李然,等.原子吸收光譜法測定不同鹿齡梅花鹿角盤礦質(zhì)元素含量〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010;38(5):2211-2.

3馮麗,李萌.病毒性心肌炎與微量元素錳關(guān)系的臨床研究〔J〕.微量元素與健康研究,2009;26(4):70.

4李萬立,羅海吉.微量元素銅與人類疾病關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.微量元素與健康研究,2008;25(1):62-5.

5宋躍進(jìn).中藥治療乳腺增生癥及對激素變化的影響〔J〕.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003;13(7):421-2.

6毛根年,許牡丹.功能食品生理特性與檢測技術(shù)〔M〕.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:352.

7黃金鳳,王維,王莘.鹿茸及鹿花盤蛋白提取物的抑菌比較〔J〕.吉林農(nóng)業(yè),2010;(9):43-55.

8Natalia Scaglia,Ariel Igal R.Stearoyl-CoA desaturase is involved in the control of proliferation,anchorage-independent growth,and survival in human transformed cells〔J〕.J Biol Chem,2005;280(27):25339-49.

9Cohen-Naftaly M,Friedman SL.Current status of novel antifibrotic therapies in patients with chronic liver disease〔J〕.Ther Adv Gastroenterol,2011;4(6):391-417.

10黃曉菡，曾文鋌，朱科倫，等.丹芪活肝膠囊對 D-氨基半乳糖致大鼠肝損傷的保護(hù)作用〔J〕.廣州醫(yī)藥，2009;40(5):44.

11Weber LW,Boll M,Stampfl A.Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes:carbon tetrachloride as a toxicological model 〔J〕.Crit Rev Toxicol,2003;33(2):105-36.

12李洪忠,萬敬員,張力，等.羥基積雪草苷對大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用〔J〕.中草藥,2008;39(10):1525-7.

13Berger ML,Bhatt H,Combes B,etal. CCl4-induced toxicity in isolatedhepatocytes:the importance of direct solvent injury〔J〕.Hepatology,1986;6(1):36-45.

14陳紅艷,嚴(yán)莉,王建華,等.甘草提取物對小鼠四氯化碳急性肝損傷的影響〔J〕.中國中醫(yī)藥信息雜志,2009;16(7):24-5.

15Koruk M,Taysi S,Savas MC,etal.Oxidative stress and enzymatic antioxidant status in patients with nonalcoholic steatohepatitis〔J〕.Acta Clin Lab Sci,2004;34:57-62.

16周斌.姬菇多糖純化及其對小鼠急性肝損傷保護(hù)作用研究〔D〕.南京：南京師范大學(xué),2012.

17Kelly MC,Whitaker G,White B,etal.Nickel(Ⅱ)-catalysed oxidative guanine and DNA damage beyond 8-oxoguanine 〔J〕.Free Radic Biol Med,2007;42(11):1680-9.

18舒紅.還原型谷胱甘肽的臨床應(yīng)用〔J〕.黑龍江醫(yī)學(xué)，2007;31(11)：840-1.

19孫設(shè)宗,孫欣,金波.香菇多糖對小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷保護(hù)作用的研究〔J〕.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2013;40(6):1035-6.

20梁莉,李志誠,王婷,等.南沙參多糖對小鼠CCl4急性肝損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國藥師,2008;11(6):617-9.

21林景超.化學(xué)性肝損傷及肝癌的代謝組學(xué)研究〔D〕.上海：上海交通大學(xué),2008.

22蘇鳳艷,李慧萍,王艷梅,等.鹿花盤蛋白質(zhì)的提取與生物活性測定〔J〕.動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué),2001;18(2):18-20.

〔2014-11-04修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1817-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.012

通訊作者：周涌(1963-)，男，教授，主要從事營養(yǎng)與慢性病研究。

基金項(xiàng)目：吉林醫(yī)藥學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目(201211)

1吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院2吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院

第一作者：黃彬彬(1990-)，女，本科在讀，主要從事臨床肝膽護(hù)理研究。