1株抗酸陽(yáng)性丙酸桿菌的分離和鑒定

姜清明，屈平華，陳　茶，陳默蕊

(1.粵北第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東韶關(guān) 512028；2.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510006；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬潮州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心,廣東潮州 521000)

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·論著·

1株抗酸陽(yáng)性丙酸桿菌的分離和鑒定

姜清明1，屈平華2，陳茶2，陳默蕊3

(1.粵北第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東韶關(guān) 512028；2.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510006；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬潮州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心,廣東潮州 521000)

摘要:目的對(duì)1株乳腺膿腫標(biāo)本分離的緩慢生長(zhǎng)革蘭陽(yáng)性抗酸桿菌進(jìn)行菌種鑒定。方法采用細(xì)菌的16S核糖體核糖核酸(rRNA)基因測(cè)序分析，結(jié)合細(xì)菌的菌體形態(tài)、生長(zhǎng)特征、API 20A和手工生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果該菌為厭氧的、無(wú)芽孢、直或彎曲的多形性桿菌，革蘭和抗酸染色為陽(yáng)性。血平板培養(yǎng)5 d形成直徑大于2 mm、米黃色、圓形、光滑、突起、邊緣整齊、β溶血性菌落。但16S rRNA基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，該菌與貪婪丙酸桿菌的同源性為100%，API 20A生化編碼為44365062，VP試驗(yàn)的陽(yáng)性，符合貪婪丙酸桿菌的特征。結(jié)論該乳腺膿腫的病原菌為貪婪丙酸桿菌，其抗酸染色陽(yáng)性，為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞:丙酸桿菌；抗酸性；細(xì)菌鑒定；序列分析

抗酸陽(yáng)性桿菌通常指的是結(jié)核分枝桿菌和其他一些非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，其廣泛存在于水、空氣、土壤等醫(yī)院相關(guān)環(huán)境中，可引起肺結(jié)核、麻風(fēng)、導(dǎo)管相關(guān)性血流感染、傷口感染?？顾彡?yáng)性桿菌的典型特征是菌體含有大量脂質(zhì)，主要為分枝菌酸，革蘭染色時(shí)結(jié)合結(jié)晶紫的能力差，甚至不著色，但采用抗酸染色時(shí)，其與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用，并保持復(fù)紅的顏色。除分枝桿菌外，一些諾卡菌屬和棒狀桿菌屬細(xì)菌，以及其他一些放線菌也具有弱抗酸性，但較為少見(jiàn)。2011年，從1例分枝桿菌培養(yǎng)的乳腺分泌物標(biāo)本中檢出1例抗酸陽(yáng)性細(xì)菌，最初錯(cuò)誤鑒定為快生長(zhǎng)分枝桿菌，后經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序，確定為貪婪丙酸桿菌，報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料門診患者，男，38歲，左乳腺表層潰瘍和深部蜂窩性組織炎，膿腫體積為(3×3×2.5)cm，穿刺有膿液。微生物檢查：膿液直接涂片發(fā)現(xiàn)抗酸陽(yáng)性桿菌；細(xì)菌培養(yǎng)和分枝桿菌培養(yǎng)均檢出無(wú)芽孢、直或彎曲的、多形性的抗酸陽(yáng)性桿菌，最初誤報(bào)為快生長(zhǎng)分枝桿菌。臨床治療采用膿腔引流和頭孢西丁抗感染治療，預(yù)后不詳。

1.2儀器與試劑TE 9600基因擴(kuò)增儀(珠海黑馬公司)；恒溫金屬浴器(杭州博日公司)；快速革蘭染色液和抗酸染液(Baso)；API 20A鑒定試條(法國(guó)梅里埃)；E-test紙條(安徽淮北宏遠(yuǎn))；Premix Ex Taq酶體系(大連Takara公司)；細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物27f(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)與1492r(5′- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3′)由上海英韋創(chuàng)津廣州公司合成。

1.3細(xì)菌培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察傷口分泌物標(biāo)本分區(qū)劃線接種血平板、普通巧克力、麥康凱平板，置于含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中35 ℃恒溫孵育，每天觀察平板的生長(zhǎng)狀態(tài)。按常規(guī)的細(xì)菌檢驗(yàn)方法，進(jìn)行革蘭染色和抗酸染色，油鏡下觀察其菌體形態(tài)照相記錄。

1.416S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序鑒定采用堿裂解法提取細(xì)菌的基因組DNA。細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[1]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送與上海英韋創(chuàng)津廣州公司進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的純化及基因測(cè)序。獲得的16S rRNA基因序列在NCBI的GenBank庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)初步確定其分類位置。

1.5生化鑒定生化鑒定包括API 20A鑒定、伏-普(VP)實(shí)驗(yàn)和厭氧生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)等，主要參考試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果分離到1種革蘭陽(yáng)性桿菌，菌體呈桿狀或弧狀；其生長(zhǎng)速度緩慢，初次培養(yǎng)5 d在血平板上可形成直徑大于2 mm、米黃色、圓形、光滑、突起、邊緣整齊、β溶血性菌落；麥康凱平板上不生長(zhǎng)；抗酸染色陽(yáng)性見(jiàn)圖1(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.216S rRNA基因測(cè)序鑒定及結(jié)果分析擴(kuò)增得到16S rRNA基因的全序列，大小約1 500 bp。PCR產(chǎn)物送與上海英韋創(chuàng)津廣州公司進(jìn)行測(cè)序，由獲得的毛細(xì)管電泳峰譜來(lái)看，其基因序列的熒光峰圖正常，無(wú)雜帶、無(wú)背景信號(hào)干擾見(jiàn)圖2(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。以DNA MAN軟件對(duì)基因序列的拼接，得到1 394 bp的有效序列，以Blast(www.ncbi.him.nih.gov/blast)的16S rRNA序列庫(kù)(細(xì)菌和真菌)進(jìn)行分析，顯示與貪婪丙酸桿菌DSM 4901(核酸登錄號(hào)NR 118647)相似率為100%，與丙酸丙酸桿菌DSM 43307(核酸登錄號(hào)NR 025277)相似率為99.4%，與丙酸桿菌屬其他種的相似度則均低于99.0%。按CLSI MM-18通用解釋標(biāo)準(zhǔn)，可初步鑒定為貪婪丙酸桿菌[2]，但需進(jìn)一步排除丙酸丙酸桿菌。

2.3生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析分離株為兼性厭氧菌，其在厭氧環(huán)境中生長(zhǎng)優(yōu)于需氧環(huán)境，且VP試驗(yàn)陽(yáng)性，符合丙酸桿菌的特征。采用API 20A試驗(yàn)，分離株吲哚實(shí)驗(yàn)陰性、脲酶陰性、葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性、乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性、蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、麥芽糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、柳醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性、阿拉伯糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性、明膠液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、七葉靈水解實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、甘油發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、纖維二糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性、甘露糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、松三糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性、棉子糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性、山梨醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性、海藻糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、觸酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，生化編碼為44365062。分離株與相關(guān)菌種生化實(shí)驗(yàn)的比較見(jiàn)表1。其中“+”為陽(yáng)性、“-”為陰性、“V”為可變、“ND”為未檢測(cè)，相關(guān)菌株的試驗(yàn)資料來(lái)自參考文獻(xiàn)[3]。

表1　分離株與丙酸桿菌相關(guān)菌種的生理生化特征比較

3討論

丙酸桿菌是一類厭氧的、不產(chǎn)生芽孢的革蘭陽(yáng)性桿菌，正常存在于人體皮膚表面。該菌營(yíng)養(yǎng)類型為異養(yǎng)厭氧型，但可以耐受微量氧氣，由于可發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸和轉(zhuǎn)化為丙酸，故命名為丙酸桿菌[4]，VP實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性是該菌的一個(gè)重要特征。臨床上，丙酸桿菌主要引起痤瘡和術(shù)后感染[5]；近年來(lái)，有多例貪婪丙酸桿菌引起乳腺炎的臨床報(bào)告[6-8]。在本例研究中，分離株為兼性厭氧革蘭陽(yáng)性桿菌，VP試驗(yàn)陽(yáng)性，符合丙酸桿菌的特點(diǎn)，API 20A生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與貪婪丙酸桿菌一致，且16S rRNA基因與貪婪丙酸桿菌相似率為100%，故可以確定為貪婪丙酸桿菌。

目前還沒(méi)有丙酸桿菌抗酸陽(yáng)性的相關(guān)報(bào)道。就抗酸染色的原理來(lái)看，該膿液標(biāo)本直接涂片抗酸陽(yáng)性，可能與皮膚皮脂腺的油脂環(huán)境和丙酸桿菌致病特性有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡丙酸桿菌分泌的磷脂酶可以將人體皮脂中的三酰甘油降解為游離脂肪酸，使其黏附在細(xì)胞表面，并具有以下作用：(1)營(yíng)養(yǎng)作用；(2)生物被膜保護(hù)作用；(3)在皮膚毛囊中的黏附和泊位作用。因此，痤瘡丙酸桿菌的脂肪酸被膜，可能是其與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合而不被酸性乙醇脫色的主要原因[9-10]。從已有的文獻(xiàn)資料來(lái)看，丙酸桿菌可通過(guò)菌體形態(tài)和革蘭染色的著色情況、血平板溶血、厭氧生長(zhǎng)、VP試驗(yàn)等與其他抗酸陽(yáng)性的分枝桿菌和諾卡菌進(jìn)行區(qū)分：(1)丙酸桿菌為革蘭陽(yáng)性桿菌，菌體微彎曲；諾卡菌亦為革蘭陽(yáng)性桿菌，菌體可見(jiàn)分枝；分枝桿菌為著色不良的革蘭陽(yáng)性桿菌。(2)丙酸桿菌可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生丙酸(因故而命名為丙酸桿菌)，其VP實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，而分枝桿菌和諾卡菌的VP實(shí)驗(yàn)為陰性。(3)丙酸桿菌為厭氧菌，而分枝桿菌和諾卡菌為嚴(yán)格需氧菌。(4)丙酸桿菌在血平板上通?？尚纬搔氯苎种U菌和諾卡菌在血平板上通常不溶血。

參考文獻(xiàn)

[1]屈平華,趙紅波,黃彬,等.衛(wèi)生部微生物室間質(zhì)評(píng)1 012菌的鑒定與放線菌屬的系統(tǒng)發(fā)生分析[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,34(1):814-819.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute.MM18-A Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2008.

[3]Downes J,Wade WG.Propionibacteriumacidifaciens sp.nov.,isolated from the human mouth[J].Int J Syst Evol Microbiol,2009,59(11):2778-2781.

[4]Kusano K,Yamada H,Niwa M,et al.Propionibacterium cyclohexanicum sp.nov.,a new acid-tolerant omega-cyclohexyl fatty acid-containing propionibacterium isolated from spoiled orange juice[J].Int J Syst Bacteriol，1997,47(3):825-831.

[5]張智,滕婷婷,程奕星.痤瘡丙酸桿菌生理生化特性及其致病性綜述[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2008,142(6):12-14.

[6]林新瑜,段西凌.痤瘡丙酸桿菌及相關(guān)性疾病[J].臨床皮膚科雜志,2009,38(2):133-134.

[7]Panagea S,Corkill JE,Hershman MJ,et al.Breast abscess caused by Propionibacterium avidum following breast reduction surgery:case report and review of the literature[J].J Infect,2005,51(5):253-255.

[8]Bradbury RS,Warren SJ,Jones DA,et al.Propionibacterium avidum causing native breast abscess[J].Clin Mic New,2011,33(19):150-151.

[9]Kritikos A,Pagin M,Borens O,et al.Identification of Propionibacteriumavidum from a breast abscess:an overlooked etiology of clinically significant infections[J].New Microbes New Infect,2014,4(1):9-10.

[10]Coenye T,Peeters E,Nelis HJ.Biofilm formation by Propionibacterium acnes is associated with increased resistance to antimicrobial agents and increased production of putative virulence factors[J].Res Microbiol,2007,158(4):386-392.

Characterization of one strain of acid-fasting Propionibacterium isolated from the breast abscess samples

JiangQingming1,QuPinghua2,ChenCha2,ChenMorui3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondPeople′sHospitalofYuebei，Shaoguan，Guangdong512028,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,theGuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510006,China;3.LaboratoryMedicalCenter,ChaozhouCentralHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Chaozhou，Guangdong521000，China)

Abstract:ObjectiveTo identify one acid-fasting bacteria isolated from wound secretion of breast abscess.MethodsThe acid-fasting strain was identified by the morphological characteristics,API 20A strips,classical biochemical reaction,and 16S rRNA gene sequencing.ResultsCells of the strain was anaerobic,non-spore-forming,pleomorphic,straight or curved rods,which Gram and acid-fast stain both were positive.After incubation for 5 days on sheep blood agar,colonies were than 2 mm in diameter,circular,smooth,entire,bump,rice cream-like with β-hemolysis.The 16S rRNA gene sequences were 100% identity to Propionibacterium avidum.The API 20A profile was 44365062 with positive Voges-Proskauer test,which was also consistent to Propionibacterium avidum.ConclusionThe pathogens of breast abscess is Proionibacterium avidum,which is the first acid-fasting Propionibacterium reported in China.

Key words:Propionibacterium;acid-fast;bacteria identification;sequence analysis

(收稿日期：2015-10-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.026

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)09-1219-02

作者簡(jiǎn)介：姜清明，男，副主任技師，主要從事臨床微生物研究。