甘薯薯塊DNA提取方法研究

張道微，張超凡，董 芳，黃艷嵐，張 亞，周 虹（.湖南省作物研究所，湖南 長(zhǎng)沙 405；.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 405）

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甘薯薯塊DNA提取方法研究

張道微1，張超凡1，董 芳2，黃艷嵐1，張 亞1，周 虹1
（1.湖南省作物研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；
2.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

摘 要：甘薯薯塊富含淀粉、酚類等物質(zhì)，不利于DNA提取。為了研究甘薯薯塊DNA提取的最佳方法，采用經(jīng)典CTAB 法、改良 CTAB 法一、改良 CTAB 法二和 SDS 提取法，對(duì)甘薯薯塊總DNA提取效果進(jìn)行比較，以試劑盒法提取結(jié)果作對(duì)照。結(jié)果表明：采用經(jīng)典CTAB提取法和SDS提取法獲得的薯塊DNA含有較多雜質(zhì)，且降解嚴(yán)重，樣品質(zhì)量低；CTAB改良法一能降低DNA樣品中多糖等物質(zhì)的含量，但DNA存在一定程度降解，且耗時(shí)較長(zhǎng)；CTAB改良法二提取效果最佳，雜質(zhì)含量低且DNA降解少，與試劑盒提取效果最接近，是一種較為理想的甘薯薯塊DNA提取方法。

關(guān)鍵詞：DNA提取；CTAB提取法；SDS提取法

甘薯是我國(guó)主要糧食作物之一，我國(guó)甘薯栽培面積和總產(chǎn)僅次于水稻、小麥和玉米，居第四位。甘薯的用途廣泛，可廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工、造紙等10多個(gè)行業(yè)，加工成數(shù)百種工業(yè)產(chǎn)品和數(shù)百種食品；同時(shí)，甘薯也是重要的新型能源用塊根作物，單位面積能量產(chǎn)量達(dá)435 MJ/(hm2·d)，遠(yuǎn)高于馬鈴薯、大豆、水稻、木薯和玉米等作物，是生產(chǎn)燃料乙醇的理想原料。資料顯示，以干物質(zhì)計(jì)，甘薯的粗淀粉含量為37.6%～77.8%，粗蛋白含量為2.24%～12.21%，可溶性糖含量為1.68%～36.02%，而鮮薯的胡蘿卜素含量最高可達(dá)208.1 mg/kg[1]。

目前，甘薯育種多采用集團(tuán)雜交的方式進(jìn)行，由于父本遺傳背景還不完全明確，不利于種質(zhì)資源的分析和管理，也對(duì)進(jìn)一步利用種質(zhì)資源造成阻礙[2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)甘薯開展了較好的基礎(chǔ)研究，對(duì)甘薯進(jìn)行分子標(biāo)記等分析，有助于更好地了解其遺傳基礎(chǔ)，為育種提供參考。

育種工作中，甘薯的性狀主要通過(guò)種薯傳遞到下一代，而在做分子標(biāo)記分析時(shí)，目前多采集甘薯莖葉做樣品來(lái)提取DNA，以甘薯薯塊為樣本的試驗(yàn)開展極少，這與高質(zhì)量提取新鮮薯塊DNA樣品的技術(shù)不成熟有關(guān)。甘薯薯塊由于富含糖類、酚類等物質(zhì)[1]，較難獲得高質(zhì)量的DNA樣品，研究采用經(jīng)典CTAB法、改良 CTAB 法一、改良 CTAB 法二和 SDS 法對(duì)甘薯薯塊總DNA的提取效果進(jìn)行比較，并以DNA提取試劑盒法作對(duì)照，以期篩選提取甘薯高質(zhì)量DNA的最佳方法，為甘薯遺傳多樣性分析、薯塊病毒DNA檢測(cè)等研究提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以高淀粉品種徐薯22為供試材料，選取健康無(wú)破損的新鮮薯塊為樣品，清洗干凈，于薯塊中間位置取樣，每個(gè)樣品重約0.5 g，切碎成小片，采用液氮研磨成粉，收集樣品進(jìn)行DNA提取。對(duì)照組中，以新鮮健康甘薯葉片為樣品，每個(gè)樣品取0.5 g。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

每種提取方法做3次重復(fù)，對(duì)每一個(gè)樣品DNA純度進(jìn)行檢測(cè)，最終結(jié)果取其平均值。

1.2.1經(jīng)典CTAB法 取0.5 g塊根切碎，放入研缽液氮研磨，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管（下同）中，加1 mL 65 ℃預(yù)熱的2% CTAB 提取緩沖液震蕩混勻，65℃水浴 30 min，每隔10 min 輕輕顛倒混勻一次；12 000 r/min離心10 min，取上清液至另一個(gè)離心管，加入等體積氯仿/異戊醇（體積比24∶1）溶液，反復(fù)混勻，使管內(nèi)溶液呈乳濁狀，12 000 r/min離心10 min；取上清液至新的離心管中，加入等體積無(wú)水乙醇，輕輕混勻，-20℃放置至白色絮狀沉淀出現(xiàn)，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，用0.5 mL 75%的乙醇洗滌兩次，7 000 r/min離心2 min，棄上清液，置于空氣中干燥；沉淀物干燥后溶于100 μL 的TE溶液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆肹3-4]。

1.2.2改良CTAB法一 取薯塊0.5 g放入研缽中，加入少許石英砂和PVP，加入1 mL緩沖液[內(nèi)含100 mmol/L Tris-HCL（pH值 8.0）、50 mmol/L EDTA （pH 值8.0）、700 mmol/L NaCl、2% PVP（聚乙烯吡咯烷酮，W/V）、2%β-巰基乙醇（V/V）]，置于離心管中；10 000 r/min 離心10 min，棄上清液；加入 600 μL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液和25 μL β-巰基乙醇，震蕩混勻；65 ℃ 水浴60 min，每隔15 min輕輕顛倒混勻；冷至室溫后，加入 240 μL KAc（5 mol/L），放入-20℃冰箱l h；10 000 r/min離心10 min；小心移取上清至另一只干凈的離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1）振蕩混勻，10 000 r/min離心10 min；取上清至另一個(gè)離心管中，加入預(yù)冷的異丙醇 640 μL ，放入-20 ℃ 冰箱l h；10 000 r/min離心 10 min，沉淀DNA，清洗和保存同經(jīng)典CTAB 法。

1.2.3改良CTAB法二 樣品處理方法和改良方法一相同，加入CTAB提取緩沖液和β-巰基乙醇65 ℃水浴1 h，12 000 r/min離心10 min，取上清加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）溶液，震蕩混勻后12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1）振蕩混勻，12 000 r/ min離心10 min，取上清加入500 μL預(yù)冷的異丙醇，放入-20 ℃ 冰箱l h；10 000 r/min離心10 min，沉淀DNA，清洗和保存同經(jīng)典CTAB法。

1.2.4SDS法 取 0.5 g 薯塊切碎置于研缽，加人1 mL 3% SDS 提取緩沖液，充分研磨成粉末，裝入離心管中65 ℃水浴60 min，每15 min顛倒混勻一次；冷卻至室溫加入 230 μL KAc（5 mol/L），顛倒混勻后冰浴60 min；10 000 r/min 離心10 min，取上清加等體積氯仿/異戊醇（24∶1）溶液，震蕩混勻后 10 000 r/ min 離心10 min；取上清液加入預(yù)冷的異丙醇600 μL溶液混勻，放入-20 ℃冰箱l h；10 000 r/min 離心10 min，沉淀 DNA；清洗和保存同經(jīng)典CTAB 法。

1.2.5試劑盒提取 采用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型，目錄號(hào)：DP305）提取甘薯葉片DNA，按照說(shuō)明書步驟操作。

1.3DNA 質(zhì)量檢測(cè)

取4 μL DNA 提取液用超純水稀釋200倍后，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)量OD260/OD280的比值；取5 μL DNA 樣品在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，制膠前加入核酸染料Goldview，結(jié)束后用凝膠成像儀拍照。

1.4SSR 標(biāo)記分析

為驗(yàn)證提取的DNA樣品在分子標(biāo)記試驗(yàn)中的適應(yīng)性，以提取的DNA樣品為模板進(jìn)行分子標(biāo)記，以上海生工合成的SSR引物（F：5'-CCAGTTCAAATCTG GGTGTC-3'；R：GGGATTGTAGTTCAATTGGT-3'）進(jìn)行擴(kuò)增，方法參照張超凡[5]博士論文。

2　結(jié)果與分析

2.1DNA提取結(jié)果分析

從圖1中可以看出，植物基因組DNA提取試劑盒對(duì)甘薯葉片DNA提取有較理想的效果，可以看到清晰的條帶，且DNA降解程度很低，沒有明顯拖帶現(xiàn)象；與之比較，該試劑盒對(duì)甘薯薯塊DNA的提取產(chǎn)量有所降低，條帶不夠明亮。其他方法中，CTAB改良法二的效果與試劑盒提取結(jié)果最接近，而經(jīng)典CTAB法提取的DNA存在明顯降解，泳道最前端有大量降解DNA存在，CTAB改良法一也存在一定程度的DNA降解現(xiàn)象；SDS提取法的結(jié)果與CTAB改良法一結(jié)果較接近。

圖1　采用不同方法提取的甘薯基因組DNA（1、2：試劑盒提取的葉片DNA；3、5：空白；4：1 kb ladder DNA mark；6：試劑盒提取；7：SDS法提??；8：CTAB改良法二提??；9：CTAB改良法一提?。?0：經(jīng)典CTAB法提?。?～10材料為薯塊）

由表1可知，甘薯薯塊DNA的取產(chǎn)量明顯低于葉片DNA，試劑盒提取也不能顯著提高甘薯薯塊DNA的產(chǎn)量，試驗(yàn)中5種薯塊DNA提取方法的產(chǎn)量比較接近，無(wú)明顯差別，其結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致。OD260/OD280的值代表DNA的純度，純DNA的OD260/OD280值接近1.8。比值大于1.9，表明有RNA污染；比值小于1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染。經(jīng)典CTAB法和SDS法提取的甘薯薯塊DNA均存在一定程度蛋白質(zhì)、苯酚等物質(zhì)污染，CTAB改良法一存在一定程度RNA等物質(zhì)污染。相對(duì)于試劑盒提取結(jié)果，CTAB改良法2提取薯塊DNA效果與之最接近。

表1　薯塊DNA提取產(chǎn)量分析

2.2SSR分子標(biāo)記克隆檢驗(yàn)

如圖2所示，以不同方法提取的甘薯薯塊DNA做模板，都能獲得PCR產(chǎn)物，其中以試劑盒提取和CTAB改良法二提取的DNA為模板所獲得PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)條帶更亮，說(shuō)明其克隆效率最高。

圖2　甘薯薯塊基因組DNA單一SSR引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

綜合以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，CTAB改良法二提取的薯塊DNA質(zhì)量最接近試劑盒法提取的。且比較提取單個(gè)樣品消耗的時(shí)間（表2）可知，CTAB改良法二消耗的時(shí)間居中。綜合來(lái)看，采用該方法既能保證獲得較高質(zhì)量的DNA產(chǎn)物，又能替代試劑盒使用，節(jié)約成本，是一種較為理想的甘薯薯塊DNA提取方法。

表2　單個(gè)樣品不同提取方法消耗時(shí)間

3　討 論

組織DNA提取是許多分子試驗(yàn)的基本環(huán)節(jié)，甘薯薯塊由于富含淀粉、酚類等物質(zhì)，不容易提取出高質(zhì)量的DNA。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，采用經(jīng)典CTAB法提取薯塊DNA，電泳檢測(cè)時(shí)點(diǎn)樣孔處有DNA條帶出現(xiàn)，可能是由于DNA中含有淀粉等物質(zhì)造成的。試驗(yàn)中采用的5種提取方法都尚未達(dá)到最佳效果，但是相對(duì)于試劑盒提取，CTAB改良法二提取獲得的DNA質(zhì)量最佳。

試驗(yàn)中，將薯塊研磨成粉末，加入CTAB或者SDS提取緩沖液65℃水浴后，由于淀粉等物質(zhì)的存在，均有不同含量的黏稠物質(zhì)形成，粘稠物質(zhì)越多，隨后離心獲得的DNA樣品中蛋白含量也就越多，這嚴(yán)重影響DNA樣品的質(zhì)量。所以，在實(shí)際操作中，取樣量與提取緩沖液的比例也是影響DNA提取結(jié)果的重要因素。為了從甘薯薯塊中得到更多的DNA，可以考慮每個(gè)樣品處理為兩管，層析后，在DNA沉淀步驟時(shí)再整合到一個(gè)離心管中。

CTAB改良法中，由于PVP能與酚類形成不溶性物質(zhì)，β-巰基乙醇能抑制酚類物質(zhì)的氧化，兩者結(jié)合處理離心后，能有效降低樣品中酚類物質(zhì)的含量[6]。加入高濃度鹽，能提高淀粉在乙醇中的溶解度，也是降低樣品中淀粉含量的有效辦法之一[7]。此外，CTAB改良法二由于增加了苯酚/氯仿/異戊醇的層析步驟，也有效減少了樣品中的雜物質(zhì)，而異丙醇對(duì)DNA的沉淀效果，比經(jīng)典CTAB提取法中乙醇的沉淀效果要好。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：成 平）

Study on Extraction Method of DNA from Sweet Potato Tuber

ZHANG Dao-wei1，ZHANG Chao-fan1，DONG fang2，HUANG Yan-lan1，ZHANG Ya1，ZHOU Hong1
（1.Hunan Crop Research Institute， Changsha 410125， PRC；
2. Longping Branch of Graduate School of Central South University， Changsha 410125， PRC）

Abstract：Potato tuber is rich in starch, phenol and other substances, which is not conducive to DNA extraction. In order to study the best extraction method of sweet potato tuber DNA, using the classical CTAB method, improved CTAB method-1, improved CTAB method-2 and SDS extraction method, to compare the sweet potato tuber total DNA extraction effect, use the extraction result of kit method as control. The results show that the classic CTAB extraction method and SDS extraction method contains more impurities, serious degradation and the quality of sample is low; the improved CTAB method-1 can reduce the content of polysaccharide and other substances in DNA samples, but DNA has a certain degree of degradation, and it consumes too much time; the improved CTAB method-2 has best extraction effect, low content of impurities and degradation of DNA, the closest extraction effect to kit method, is an ideal method for extracting DNA from sweet potato tuber.

Key words：DNA extraction; CTAB extraction method; SDS extraction method

通訊作者：張超凡

作者簡(jiǎn)介：張道微（1987-），男，湖南武岡市人，助理研究員，主要從事甘薯育種工作。

基金項(xiàng)目：國(guó)家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-11-C-16）

收稿日期：2016-02-04

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.04.002

中圖分類號(hào)：Q946-33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-060X（2016）04-0005-03