復(fù)榮通脈膠囊對(duì)糖尿病大鼠心肌TGF-β1及CTGF表達(dá)水平的影響研究

屈會(huì)云，王立新

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061001)

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復(fù)榮通脈膠囊對(duì)糖尿病大鼠心肌TGF-β1及CTGF表達(dá)水平的影響研究

屈會(huì)云，王立新

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061001)

[摘要]目的觀察經(jīng)驗(yàn)方復(fù)榮通脈膠囊對(duì)糖尿病大鼠心肌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的影響，探討其對(duì)糖尿病心肌病的可能作用機(jī)制，為臨床防治糖尿病心肌病提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法將雄性Wistar大鼠88只隨機(jī)分為正常組、模型組、復(fù)榮通脈膠囊低劑量組及復(fù)榮通脈膠囊高劑量組，每組22只。除正常組外，其余組均采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型。造模成功后，復(fù)榮通脈膠囊低劑量組和高劑量組分別給予復(fù)榮通脈膠囊混懸液0.67 g/(kg·d)和1.34 g/(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃8周后，測(cè)量各組體質(zhì)量、血糖、TC、TG，免疫組化法檢測(cè)心肌組織中TGF-β1、CTGF表達(dá)情況。結(jié)果灌胃8周后，正常組體質(zhì)量明顯高于灌胃前(P<0.05)，模型組和復(fù)榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組體質(zhì)量均明顯低于灌胃前及正常組(P均<0.05)；各組血糖水平與灌胃前比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，模型組和復(fù)榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組比較差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；各組間TC比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，模型組TG明顯高于正常組(P<0.05)，復(fù)榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組TG與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；復(fù)榮通脈膠囊高劑量組心肌組織中TGF-β1、CTGF表達(dá)水平明顯低于模型組和復(fù)榮通脈膠囊低劑量組(P均<0.05)。結(jié)論復(fù)榮通脈膠囊可下調(diào)TGF-β1、CTGF在糖尿病大鼠心肌組織中的表達(dá)，從而發(fā)揮其對(duì)糖尿病心肌病的治療作用，但具有劑量依賴性。

[關(guān)鍵詞]糖尿病心肌??；復(fù)榮通脈膠囊；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

糖尿病心肌病(diabetio cardio myopathy，DCM)是糖尿病的微血管病變之一，亦是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因之一。有研究顯示補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)糖尿病有治療作用[1]，且加味補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠改善糖尿病患者的微循環(huán)障礙[2]。我院制劑復(fù)榮通脈膠囊是在補(bǔ)陽(yáng)還五湯的基礎(chǔ)上加減化裁而成，在臨床應(yīng)用中可明顯改善糖尿病心肌病患者胸悶、憋氣癥狀，提高左室射血分?jǐn)?shù)，但作用機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察復(fù)榮通脈膠囊對(duì)糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著極為關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的影響，探討復(fù)榮通脈膠囊可能的作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)，為防治糖尿病心肌病提供科學(xué)、客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物88只健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～210 g，由北京維通利華生物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：11400700005601，單位許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2試劑鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸鈉(美國(guó)Sigma公司)，TGF-β1、CTGF免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。復(fù)榮通脈膠囊含水蛭、全蝎、地龍、當(dāng)歸、黃芪、玄參、川牛膝、葛根、首烏藤、甘草、穿山龍，院內(nèi)制劑，批準(zhǔn)文號(hào)：冀藥制字Z20070041，生產(chǎn)批號(hào)：130301，規(guī)格：每粒0.5 g，相當(dāng)于生藥2 g。使用時(shí)按比例加蒸餾水制成混懸液。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組及造模將88只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、復(fù)榮通脈膠囊低劑量組及復(fù)榮通脈膠囊高劑量組，每組22只。適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d后準(zhǔn)備造模，所有大鼠于造模前禁食12 h。參照文獻(xiàn)[3]方法，各造模組均予腹腔一次性注射1% STZ(臨用前將STZ溶于0.1 mol/L、pH 4.2的無(wú)菌檸檬酸緩沖液中，10 min內(nèi)用完)60 mg/kg，正常組一次性腹腔注射等容量檸檬酸緩沖液。造模72 h后，尾靜脈取血測(cè)量血糖值，血糖值≥16.7 mmol/L確定為造模成功。造模過(guò)程中大鼠無(wú)死亡，血糖值未達(dá)標(biāo)10只棄去不用，最后納入觀察的大鼠正常組22只，模型組18只，復(fù)榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組各19只。

1.3.2給藥方法造模成功后24 h開(kāi)始給藥。參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，按人體-大鼠體表面積比值表?yè)Q算出大鼠的等效劑量，復(fù)榮通脈膠囊低劑量組和高劑量組分別給予復(fù)榮通脈膠囊混懸液0.67 g/(kg·d)和1.34 g/(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。大鼠灌胃容量10 mL/(kg·d)，連續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)階段大鼠進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水，實(shí)驗(yàn)室溫度控制在(24±2)℃，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組均未使用其他任何藥物。

1.3.3標(biāo)本留取方法灌胃8周后，所有大鼠空腹稱體質(zhì)量，尾靜脈取血測(cè)血糖。接著以3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血2 mL置于不抗凝管，分離血清，用日立7600-010全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC、TG。然后開(kāi)胸取出心臟，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，取心尖部心肌，切成2 mm×2 mm×2 mm左右的組織塊，放入盛有4%中性甲醛固定液的小瓶?jī)?nèi), 送病理室行TGF-β1、CTGF免疫組化檢測(cè)。

1.3.4免疫組化測(cè)定方法石蠟切片厚4 μm，常規(guī)脫蠟至水；將切片置于3%過(guò)氧化氫甲醇溶液中，室溫震蕩約15 min以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗2次，每次5 min；采用微波修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)。之后用0.01 mol/L PBS洗2次，每次5 min；加入正常山羊血清，溫度37 ℃，30 min以封閉內(nèi)源性生物素；將血清甩掉，加一抗，4 ℃過(guò)夜。再次用0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃，25 min。繼續(xù)用0.01 mol/L PBS連續(xù)沖洗3次，每次5 min，然后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(SP)，37 ℃，20 min。接著用0.01 mol/L PBS沖洗4次，每次5 min。用新配制的DAB液顯色，在光鏡下控制顯色程度；最后用蒸餾水沖洗、終止顯色。蘇木素輕度復(fù)染，脫水、封片。

1.3.5結(jié)果判定免疫組化結(jié)果用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)分析，TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)主要在大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)，CTGF陽(yáng)性表達(dá)主要在大鼠心肌間質(zhì)細(xì)胞，兩者在血管周圍也可出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。鏡下隨機(jī)選擇5～10個(gè)視野，計(jì)數(shù)100～200個(gè)細(xì)胞，胞漿黃染為陽(yáng)性。染色判定用二級(jí)計(jì)分法，即根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分級(jí)，最后以二者分?jǐn)?shù)之和作為最終結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；無(wú)著色0分，淡黃色1分，黃或深黃色2分，褐或棕褐色3分。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡9只，最終正常組22只，模型組16只，復(fù)榮通脈膠囊低劑量組15只，復(fù)榮通脈膠囊高劑量組16只。

2.2各組大鼠灌胃前后體質(zhì)量變化情況各組大鼠灌胃前體質(zhì)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。灌胃8周后，正常組體質(zhì)量明顯高于灌胃前(P<0.05)，模型組和復(fù)榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組體質(zhì)量均明顯低于灌胃前及正常組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組大鼠灌胃前后血糖變化情況灌胃前模型組、復(fù)榮通脈膠囊低劑量組和高劑量組大鼠血糖水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；灌胃8周后，各組血糖水平與灌胃前相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，模型組、復(fù)榮通脈膠囊低劑量組和高劑量組組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4各組大鼠灌胃后血清TG、TC比較各組間TC比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，模型組TG明顯高于正常組(P<0.05)，復(fù)榮通脈膠囊低劑量組、高劑量組TG與模型組和正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

表1　各組大鼠灌胃前后體質(zhì)量變化情況±s，g)

注：①與灌胃前比較，P<0.05；②與正常組比較，P<0.05。

表2　各組大鼠灌胃前后血糖變化情況±s，mmol/L)

注：①與正常組比較，P<0.05。

表3　各組大鼠灌胃后血清TG、TC比較

注：①與正常組比較，P<0.05。

2.5各組大鼠心肌組織中TGF-β1、CTGF表達(dá)情況TGF-β1在正常組大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)中呈弱陽(yáng)性表達(dá)；模型組大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)及血管周圍出現(xiàn)較多棕黃色顆粒物質(zhì)，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；復(fù)榮通脈膠囊高劑量組大鼠心肌細(xì)胞胞質(zhì)及血管周圍棕黃色顆粒較模型組大鼠明顯較少、減弱，而復(fù)榮通脈膠囊低劑量組與模型組比較TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)未見(jiàn)明顯減弱。CTGF在正常組大鼠心肌間質(zhì)細(xì)胞及血管周圍可見(jiàn)少許淡黃著色；模型組大鼠心肌間質(zhì)細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞可見(jiàn)大量棕黃色顆粒物質(zhì)，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；復(fù)榮通脈膠囊高劑量組大鼠心肌間質(zhì)棕黃色物質(zhì)較模型組明顯減少、減弱，而復(fù)榮通脈膠囊低劑量組與模型組比較CTGF陽(yáng)性表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。見(jiàn)圖1～8及表4。

3討論

TGF-β1是一種多效性細(xì)胞因子,其重要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解。研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病成模后6周血清和心肌局部的TGF-β1水平即明顯增加，且隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高[4]。鐘明等[5]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病大鼠左室心肌組織膠原含量、TGF-β1蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯升高,存在心肌間質(zhì)纖維化。經(jīng)TGF-β1抗體干預(yù)后，TGF-β1的活性被抑制，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子水平及心肌膠原含量隨之下降，心肌纖維化減輕[6]。顯示TGF-β1參與了糖尿病心肌病心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

圖1　正常組心肌組織中TGF-β1 表達(dá)情況(×400)

圖2　模型組心肌組織中TGF-β1表達(dá)情況(×400)

圖3　復(fù)榮通脈膠囊低劑量組心肌組織中TGF-β1表達(dá)情況(×400)

圖4　復(fù)榮通脈膠囊高劑量組心肌組織中TGF-β1 表達(dá)情況(×400)

圖5　正常組心肌組織中CTGF表達(dá)情況(×400)

圖6　模型組心肌組織中CTGF表達(dá)情況(×400)

圖7　復(fù)榮通脈膠囊低劑量組心肌組織中CTGF表達(dá)情況(×400)

圖8　復(fù)榮通脈膠囊高劑量組心肌組織中CTGF表達(dá)情況(×400)

組別nTGF-β1CTGF正常組221.50±1.061.59±1.10模型組164.56±1.26①②4.44±1.36①②復(fù)榮通脈膠囊低劑量組154.47±1.19①②4.13±1.68①②復(fù)榮通脈膠囊高劑量組162.00±1.211.63±1.09

注：①與正常組比較，P<0.05；②與復(fù)榮通脈膠囊高劑量組比較，P<0.05。

CTGF是一種致纖維化生長(zhǎng)因子。研究發(fā)現(xiàn),在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠和小鼠心室中CTGF表達(dá)明顯增高，并且隨著病程的進(jìn)展，CTGF 呈持續(xù)增高，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、成纖維細(xì)胞合成的膠原蛋白增加，心肌細(xì)胞肥大，證明CTGF參與了糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展[7]。

中醫(yī)學(xué)中并無(wú)“糖尿病心肌病”的病名，但根據(jù)其發(fā)病特點(diǎn)和常見(jiàn)證候，屬中醫(yī)“心悸”“怔忡”“胸痹”“厥心痛”等范疇。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，“瘀”貫穿了其發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程。復(fù)榮通脈膠囊方專為消渴心脈瘀阻、氣陰不足而設(shè)，方中水蛭、全蝎、地龍化瘀、通絡(luò)、熄風(fēng);黃芪、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血，補(bǔ)固正氣；玄參、葛根養(yǎng)陰生津；川牛膝化瘀而引血下行；穿山龍活血而暢通經(jīng)脈。該方補(bǔ)通結(jié)合，潤(rùn)活相滋，使正氣存，邪氣散，共達(dá)復(fù)榮通脈之功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃8周后，模型組大鼠體質(zhì)量、血糖、血脂與復(fù)榮通脈膠囊高、低劑量組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示復(fù)榮通脈膠囊對(duì)糖尿病心肌病的治療不是通過(guò)降低體質(zhì)量、調(diào)節(jié)糖脂代謝發(fā)揮作用的。而復(fù)榮通脈膠囊高劑量組心肌組織中TGF-β1、CTGF表達(dá)水平明顯低于模型組和復(fù)榮通脈膠囊低劑量組，提示復(fù)榮通脈膠囊能夠下調(diào)TGF-β1、CTGF在糖尿病心肌組織的表達(dá)，從而發(fā)揮其對(duì)糖尿病心肌病的治療作用，但具有劑量依賴性。在今后的實(shí)驗(yàn)中可將給藥劑量進(jìn)一步細(xì)化，以確定可達(dá)到預(yù)期療效的劑量。

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Experimental study on intervention effects of Furongtongmai capsule on the expression level of myocardial TGF-β1and CTGF in diabetic rats

QU Huiyun ,WANG Lixin

(Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Hebei Medical University, Cangzhou 061001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the intervention effects of Furongtongmai capsule on the expression level of myocardial TGF-β1 and connective tissue growth factor (CTGF) in diabetic rats, and to explore its possible mechanism on diabetic cardiomyopathy. Methods 88 male Wistar rats were randomly divided into four groups: normal control group (NC group), diabetic model control group(DM group), Furongtongmai capsule low-dose (FRL) and high-dose treated(FRH) groups with 22 rats in each group. The diabetic rat models were created by intraperitoneal injection of streptozocin(STZ) in all groups except NC group. After the models were successfully established, FRL group and FRH group were given Furongtongmai capsule 0.67 g/(kg·d) and 1.34 g/(kg·d) respectively by lavage, NC group and DM group were given normal saline by lavage. After treatment for 8 weeks, body weight (BW) was measured, blood glucose (BG), TC and TG were tested with automatic biochemical analyzer, and myocardial TGF-β1 and CTGF were detected by immunoshistochemistry assay. Results After 8 weeks, BW of the rats were higher in NC group while that in DM group and FRL and FRH groups were lower than those before lavage(P>0.05). No significant change of BG was found in every group compared with that before lavage (P>0.05). There was no significant difference in TC and BG among every group (P>0.05), but the level of TG was higher in DM group than that in NC group (P>0.05), no significant difference in TG was found between Furongtongmai capsule treatment groups and DM group(P>0.05). The expression level of TGF-β1 and CTGF in FRH group was lower than that in DM group and FRL group (P<0.05). Conclusion Furongtongmai capsule can down-regulate the expression of TGF-β1 and CTGF in myocardial tissue in DM rats, thus to play its treatment effect on diabetic cardiomyopathy, but dose dependence is also needed.

Key words:diabetic cardiomyopathy; Furongtongmai capsule; TGF-β1; connective tissue growth factor

[收稿日期]2015-10-10

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)14-1495-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.005

[作者簡(jiǎn)介]屈會(huì)云，女，碩士,從事中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌基礎(chǔ)及臨床研究工作。