酶抑制法快速定性檢測(cè)水果中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒方法

張立新

摘要：有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制昆蟲(chóng)中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酶的活性。照此原理，利用專用提取液提取水果中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，加入農(nóng)藥殘毒檢測(cè)專用酶試劑后，專用酶試劑就會(huì)被從水果中提取得到有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥所抑制。用速測(cè)儀檢測(cè)酶的抑制率，根據(jù)酶試劑的抑制率來(lái)判定水果中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥是否超標(biāo)，從而達(dá)到快速判定水果是否可以安全食用的目的。

關(guān)鍵詞：酶抑制法；快速檢測(cè)；水果農(nóng)藥殘毒

文章編號(hào)：1005-345X（2016）01-0041-02中圖分類號(hào)：S481+.8文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

人們對(duì)水果食用安全的要求隨著生活水平的提高也越來(lái)越高。加強(qiáng)果品質(zhì)量監(jiān)控，尤其是加強(qiáng)水果農(nóng)藥殘毒檢測(cè)，是提高果品質(zhì)量安全水平，保障百姓“舌尖上的安全”的關(guān)鍵措施之一。采用氣象色譜儀檢測(cè)水果農(nóng)藥殘毒，固然以其精度高、檢測(cè)項(xiàng)目較多等特點(diǎn)而為大多實(shí)驗(yàn)室所采用。但是，此檢測(cè)方法儀器設(shè)備投入資金數(shù)額大、檢測(cè)成本高、檢測(cè)場(chǎng)所固定、檢測(cè)環(huán)境條件要求高、人員操作技術(shù)水平要求較高等特點(diǎn)決定了不太適合生產(chǎn)基地和流通領(lǐng)域要求的快速檢測(cè)。采用酶抑制方法，對(duì)水果中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行定性快速檢測(cè)，儀器和試劑投入成本低、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易學(xué)、檢測(cè)速度快、檢測(cè)不受實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所限制，是水果生產(chǎn)基地和超市、水果店等流通領(lǐng)域快速自行檢測(cè)的實(shí)用方法。

1酶抑制法工作原理

有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制昆蟲(chóng)中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酶的活性，造成神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的積累，影響正常傳導(dǎo)，使昆蟲(chóng)中毒死亡。根據(jù)這一原理，在水果含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥提取液中加入類似于乙酰膽堿酶的酶試劑，如果水果的提取液中不含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或殘留量較低，酶的活性不被抑制或抑制程度小，實(shí)驗(yàn)中加入的底物就被酶水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化。反之，如果水果的提取液中含有一定量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，酶的活性就被抑制或部分被抑制，試驗(yàn)中加入的底物就不能被酶水解或少部分被水解，從而不顯色或顏色變化很小。用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值隨時(shí)間的變化情況計(jì)算出抑制率，就可以判斷水果中含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留情況。

2儀器、試劑與判定標(biāo)準(zhǔn)

北京強(qiáng)盛儀器廠生產(chǎn)的NY-III型6通道農(nóng)藥殘毒檢測(cè)儀、NY-Ⅳ型8通道農(nóng)藥殘毒檢測(cè)儀；配套上海瑞鑫科技儀器有限公司出品的農(nóng)藥殘毒速測(cè)試劑，包括提取液試劑1袋、底物1瓶、顯色劑1瓶和酶試劑1瓶，應(yīng)從專業(yè)商家

山西果樹(shù)SHANXIFRUITS 2016（1）

購(gòu)買；測(cè)試結(jié)果為有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)酶的抑制率；測(cè)試結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為，測(cè)試樣品的酶抑制率達(dá)到50%以上，其農(nóng)藥殘留毒性可能超過(guò)安全界定標(biāo)準(zhǔn)。適應(yīng)檢測(cè)的水果有蘋(píng)果、梨、桃、李、杏、香蕉、火龍果、芒果、獼猴桃、木瓜、柚、檸檬等水果。

3檢測(cè)方法

3.1試劑配制與保存

將提取液試劑袋中的試劑溶于510 mL蒸餾水中，溶解、混勻，配成提取液。向底物試劑瓶中加入3.1 mL蒸餾水，溶解、混勻，備用。在0～4 ℃環(huán)境中保存，可使用5 d。向顯色劑試劑瓶中加入32 mL提取液，溶解、混勻，備用。避光冷藏保存。向酶試劑瓶中加入3.1 mL提取液，溶解、混勻。在0～4 ℃環(huán)境中保存，可使用5 d。未經(jīng)配制的酶、底物粉劑儲(chǔ)存在冰箱0 ℃以下冷凍室保存，有效期為1年。

3.2操作步驟

3.2.1準(zhǔn)備工作及取樣開(kāi)機(jī)預(yù)熱10 min，按確定鍵進(jìn)行儀器自檢。隨機(jī)抽取水果樣本，每個(gè)樣本至少取0.5～1.0 kg，樣品必須具有代表性。即從水果表皮至果肉0.5～1 cm處取樣，取1 g放入燒杯中，加入5 mL提取液，常溫下靜置10 min，每3 min晃動(dòng)一下燒杯，以使水果中農(nóng)藥充分溶解，或振蕩提取2 min，過(guò)濾，濾液即為待檢測(cè)液。NY-III型儀器提取6個(gè)樣品，NY-Ⅳ型提取8個(gè)樣品。

3.2.2對(duì)照測(cè)試對(duì)照測(cè)試在樣本測(cè)試之前4 min進(jìn)行。取提取液2.5 mL、酶0.1 mL和0.1 mL顯色劑，加入燒杯中，混勻靜置15 min（秒表計(jì)時(shí)，常溫25～35 ℃）后，立即加入底物0.1 mL。倒置兩次混勻后（切勿震蕩產(chǎn)生氣泡），立即轉(zhuǎn)移到比色皿中，快速放入儀器比色池內(nèi)，蓋好蓋板，按對(duì)照測(cè)試鍵執(zhí)行對(duì)照制作程序。對(duì)照值在30以上為有效值，反之重做對(duì)照測(cè)試。測(cè)試完畢，馬上將對(duì)照液從比色池內(nèi)取出。

3.2.3樣品測(cè)試取待檢測(cè)液2.5 mL加入燒杯中，加入酶液0.1 mL和顯色劑液0.1 mL，混勻靜置15 min（秒表計(jì)時(shí)，常溫25～35 ℃）后，馬上加入底物0.1 mL，倒置兩次后（切勿震蕩產(chǎn)生氣泡），立即轉(zhuǎn)移到比色皿中，快速放入儀器比色池，蓋好蓋板，按樣品測(cè)試鍵執(zhí)行樣品檢測(cè)程序。

3.2.4測(cè)試結(jié)果的判讀若測(cè)試樣品的酶抑制率達(dá)到50%以上，則表明被測(cè)樣品的農(nóng)藥殘留毒性可能超過(guò)安全的界定標(biāo)準(zhǔn)，建議復(fù)檢一次或通過(guò)氣相色譜等儀器檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)。

4檢測(cè)結(jié)果誤差分析

在實(shí)驗(yàn)操作中，由于移液槍使用、操作速度、揭遮光蓋時(shí)間快慢、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短等都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，操作不合理就會(huì)造成誤差。

同時(shí)實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度變化引起酶活性變化，實(shí)驗(yàn)儀器是否清潔對(duì)折光率的判斷，也會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)誤差。

另外，所取果皮的厚度，對(duì)檢測(cè)結(jié)果有非常重要的影響。果皮越薄，接觸農(nóng)藥的面積越大，檢測(cè)結(jié)果為不合格的概率就越大。果皮越厚，所含的果汁和色素就越多，對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的誤差就越大。再加上不同水介質(zhì)的成分差別較大，水中含有的礦物質(zhì)成分、酸性物質(zhì)、堿性物質(zhì)都會(huì)對(duì)檢測(cè)的結(jié)果產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)中所用試劑的提取液量多可以稀釋農(nóng)殘，酶量多可以提高分解底物的速度，顯色劑量多可以增加顯色的程度，底物量多可以提高酶的利用效率，以上這些因素都能增加檢測(cè)結(jié)果合格的可能性。因此檢測(cè)過(guò)程中的試劑使用量應(yīng)經(jīng)過(guò)科學(xué)計(jì)算，嚴(yán)格遵守《NY-Ⅳ型農(nóng)藥殘毒速測(cè)儀》使用說(shuō)明及《農(nóng)藥殘毒速測(cè)試劑》使用說(shuō)明。