黃瓜霜霉病菌與抗性研究進展

席亞東 向運佳 韓帥 張河慶 吳婕 李洪浩 劉波微 陳國華

摘要：科學利用抗性品種及抗性基因是控制黃瓜霜霉病最經(jīng)濟、有效的途徑。文章對黃瓜霜霉病菌及其抗病性的相關研究進行了全面綜述，總結了黃瓜霜霉病菌的侵染和流行規(guī)律，比較分析了國內(nèi)外不同學者在接種和抗霜霉病性鑒定等方面存在的差異，論述了抗病基因定位的主流方法和最新技術，指出控制霜霉病抗病基因目前尚存在單基因、多基因的不同結論。提出今后應加強輕簡化和標準化的抗病性鑒定方法研究，明確霜霉病抗性基因，篩選和創(chuàng)制出更多、更優(yōu)異的抗性品種和資源。

關鍵詞： 黃瓜霜霉病菌；抗性鑒定；抗性基因；基因定位；研究進展

中圖分類號： S436.421.11 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1709-06

0 引言

我國是黃瓜（Cucumis sativus Linn.）次生起源地之一（Mliki et al.，2003），擁有豐富的黃瓜種質資源。2013年，我國黃瓜栽培面積達116萬ha，占世界黃瓜總栽培面積的55%。由古巴假霜霉病菌[Pseudoperonospora cubensis（Berk. & Curt.） Rostov]引起的黃瓜霜霉病是世界范圍內(nèi)黃瓜產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，在整個生育期均可危害黃瓜，輕者造成減產(chǎn)10%～20%，重則在30%以上。與化學藥劑防治相比，選育抗病品種是防治黃瓜霜霉病最經(jīng)濟、有效、安全、環(huán)保的長期控制策略。建立一套科學、準確的抗病性鑒定與評價方法，是篩選抗源和抗病品種的必要條件，也是利用抗霜霉病黃瓜品種的必要前提，而明確黃瓜抗霜霉病的遺傳規(guī)律和抗病基因，有利于育種的目的性和縮短育種年限。因此，對黃瓜霜霉病菌、抗病性鑒定與評價及基因定位的深入了解，可為黃瓜霜霉病的可持續(xù)治理和抗病育種提供理論依據(jù)和實踐支撐。

1 黃瓜霜霉病菌的研究進展

1. 1 黃瓜霜霉病病原菌的分類地位

黃瓜霜霉病菌早在19世紀就在黃瓜上被發(fā)現(xiàn)，但直到20世紀80年代才得到廣泛關注，現(xiàn)已成為世界性的重要病害之一。黃瓜霜霉病菌（P. cubensis）屬藻物界（茸鞭生物界）、卵菌門、霜霉目、假霜霉屬，稱為古巴假霜霉菌，是一種專性寄生菌，在親緣關系上與黃綠藻較接近，與真菌較遠。

1. 2 受黃瓜霜霉病菌侵染的癥狀

古巴假霜霉菌不會對整株植物造成系統(tǒng)性侵染（Cohen，1981），僅在葉片上表現(xiàn)出癥狀，但在受害嚴重的瓜類莖、葉柄、卷須、花梗上均可觀察到孢囊梗（Lebeda and Cohen，2011）。黃瓜可在不同的生育期受害，但新長出的葉片很少表現(xiàn)出癥狀（Lebeda，1990），在霜霉病暴發(fā)的季節(jié)，霜霉病嚴重發(fā)生的黃瓜成株期的幼嫩新葉未有病斑顯癥。實際上，子葉最容易發(fā)病，黃瓜新長出的葉片很少顯癥的現(xiàn)象值得深入研究和探討。黃瓜霜霉病的典型癥狀是葉片初期出現(xiàn)水浸狀小斑點，后期病斑擴展受葉脈限制而形成黃褐色的多角形病斑，空氣相對濕度大時葉背會長出紫黑色霉層，但在實際生產(chǎn)中不同品種的黃瓜霜霉病癥狀具有多樣性。

1. 3 黃瓜霜霉病菌的侵染機制

古巴假霜霉菌最初和最主要的侵染單元是無性孢子（孢子囊），孢子囊在風力和水滴飛濺條件下很容易脫落進行擴散，當其落在葉片表面后，需要有水（如雨或者露）才能萌發(fā)。孢子囊萌發(fā)過程：多核的原生質體分化成5～15個雙鞭毛的游動孢子（Palti and Cohen，1980），游動孢子向氣孔方向游動、休止、失去鞭毛內(nèi)裹成囊，隨后長出芽管，產(chǎn)生附著孢并形成侵染菌絲，侵入到葉組織的氣孔到氣腔。通過氣孔侵入是古巴假霜霉菌最頻繁的侵染機制（Cohen，1981），與萵筍霜霉病直接的侵入（表皮）不同。古巴假霜霉菌的病理過程如圖1所示（Lebeda and Cohen，2011）。

古巴假霜霉菌卵孢子的侵染比較少見。據(jù)最新報道，古巴假霜霉菌可通過種子傳播（Cohen et al.，2014）。

1. 4 黃瓜霜霉病菌的流行規(guī)律

黃瓜霜霉病菌在相對濕度RH≥84%時更易侵染（Cohen and Rotem，1971），在孢子囊萌發(fā)期間，短暫的干旱（10～15 min）能夠中斷整個侵染過程（Cohen and Eyal，1977）。最適宜侵染的溫度不同學者的報道有所差異。Cohen和Eyal（1977）認為10～20 ℃為最適宜溫度，而石延霞等（2005）認為15～35 ℃的交替溫度變化最有利于霜霉菌的侵染，且在高濕條件下，一定的高溫（35 ℃以下）更有利于黃瓜霜霉病的發(fā)生。缺氧條件下不利于游動孢子囊釋放游動孢子；光線強弱也對侵染有所影響；孢子囊的形成過程與光照關系不明顯，有無光照均可形成，但孢子囊分化成游動孢子只需在黑暗條件下進行。

在自然條件下，古巴假霜霉菌的潛育期為4～12 d，潛育期長短取決于氣候條件和寄主的基因型（Lebeda，1986）。在侵染初期，白天溫度25～30 ℃和晚上10～15 ℃更適宜侵染。當黃瓜葉片上孢子囊的濃度為103/cm2葉時，初次顯癥時間為3～4 d，而當濃度下降到10/cm2葉時，顯癥時間需要7 d或更長（Cohen and Eyal，1977）。

風力傳播是古巴假霜霉菌遠距離傳播的主要和最有效的方式（Lebeda，1990）。

2 黃瓜抗霜霉病的鑒定研究

2. 1 接種方法、接種濃度、接種量、接種期及培育溫度

在進行黃瓜霜霉病抗性鑒定時，不同的學者所采用的接種方法、接種濃度、接種量、接種期及培育溫度有所差異。周鳳珍和王永健（1987）在黃瓜幼苗子葉展開期時以5×103～1×104個/mL孢子囊懸浮液進行點滴接種，在接種后溫度為23～26 ℃時能體現(xiàn)抗、中、感的差異，且認為以2×104個/mL以上濃度接種后抗感無差異；翁祖信等（1991）在溫度為16～26 ℃時，以孢子囊濃度1.5×103～4.5×103個/mL采用子葉點滴法進行接種，品種間抗性差異明顯；Lebeda（1992）在溫度為15 ℃下，以105個/mL的孢子囊懸浮液用噴霧方法對19個野生種類的黃瓜進行霜霉病抗性鑒定，未發(fā)現(xiàn)有抗性品種；歐陽柳等（2008）在25 ℃條件下，以5×105個/mL的孢子囊懸浮液在2葉期進行點滴接種，品種間抗感差異明顯；Heerden等（2014）在21 ℃下，以5×105個/mL游動孢子的懸浮液在5～6葉期進行接種鑒定，采用接種量為20 μL的葉盤點滴法進行接種，抗感差異明顯。

2. 2 鑒定方法

2. 2. 1 田間鑒定 田間接種鑒定分為非人工接種和人工接種鑒定。非人工接種是利用感病品種作為誘發(fā)品種，自然發(fā)病后進行病情嚴重度調(diào)查，并依據(jù)嚴重度判定抗、感類型。Wehner和Shetty（1997）、Call等（2012）利用自然發(fā)病條件對黃瓜進行了抗霜霉病鑒定；Dhillon等（1999）在自然發(fā)病條件下對217個黃瓜地方品種進行了抗霜霉病鑒定，并鑒定出9個最抗的品種起源于日本。Horejsi等（2000）采用2.5×104個/mL的孢子囊懸浮液在田間進行接種鑒定。

2. 2. 2 室內(nèi)鑒定 室內(nèi)鑒定需采用懸浮液接種離體葉片或培養(yǎng)箱中活體黃瓜葉片，根據(jù)葉片發(fā)病程度進行抗病類型的鑒定。Shetty等（2002）采用5×103個/mL孢子囊懸浮液在黃瓜2片真葉期進行噴霧接種，接種后在20 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～8 d，調(diào)查病情并鑒定品種的抗性類型。

3 抗性基因定位研究方法

3. 1 分子標記與抗性基因定位

分子標記技術應用于抗性基因定位可分為四類：第一類是基于雜交的分子標記，如RFLP分子標記（Foolad and Zhang，2015）；第二類是基于PCR的分子標記，如SRAP（Ma et al.，2015）和SSR（Petersen et al.， 2015）標記方法；第三類是基于限制性內(nèi)切酶和PCR結合的分子標記，如AFLP標記的指紋技術（Zhang et al.，2015）；第四類是基于單核苷酸多態(tài)性的分子標記，如SNP構建圖譜的抗性基因定位技術（Stevanato et al.，2015）。目前，以上分子標記技術已廣泛應用于抗性基因定位研究（Moghaddam et al.，2012；Tao et al.，2013）。

3. 2 基于高通量測序的基因定位

利用高通量測序技術對基因組測序、重測序和表達序列測序可為基因定位提供快速而準確的信息（Ogura and Busch，2014）。二代測序技術使區(qū)間定位與候選基因識別可通過測序完成（Schneeberger et al.，2009）。對于變異較少的材料，可通過測序直接獲取候選基因（Lin et al.，2013）。通過構建遺傳圖譜定位突變位點的方法適用于幾乎所有植物，目前在較小的基因組模式生物中已獲得一定進展（Gao et al.，2013； Xu et al.，2013）。隨著三代測序技術的發(fā)展，抗性基因的定位越來越精細。

3. 3 SLAF-seq（Specific length amplified fragment sequencing）技術

SLAF-seq技術是一種發(fā)掘SNP和大規(guī)?；蚍中偷男录夹g，由位點特異擴增與高通量測序技術聯(lián)合發(fā)展而來（Sun et al.，2013）。SLAF-seq技術具有準確性高、信息豐富、周期短、成本低等優(yōu)勢，已成功應用于水稻抗稻瘟?。–hen et al.，2016）、番茄葉霉?。╖hao et al.，2016）等抗性基因的定位。隨著SLAF-seq新技術的大量應用，必將推動抗病性育種的發(fā)展和進步。

4 黃瓜抗霜霉病遺傳規(guī)律研究

目前，國內(nèi)外學者對黃瓜抗霜霉病遺傳規(guī)律的研究存在分歧。早在1938年Cochran使用耐病品種Bangalare和感病品種雜交，通過對親本和后代進行遺傳分析，證明抗性由數(shù)個基因決定。Doruchoowski和Lakowska-Ryk（1992）利用親本W(wǎng)isconsin SMR 18（感病）和WI4783（抗?。樵牧?，研究證明了抗霜霉病的基因是由3對隱性基因dm-1、 dm-2和dm-3決定。Szczechura等（2015）通過對抗病品種和感病品種雜交所得的F2進行連鎖圖譜構建和QTL定位分析，證明抗病品種PI 197085對霜霉病的抗性具有多基因特征。Wang等（2016）利用抗性材料PI 330628和感病材料9930為研究對象，發(fā)現(xiàn)抗霜霉病基因是由QTL位點dm2.1、dm4.1、dm5.1和 dm6.1決定。

國內(nèi)外也有報道稱黃瓜抗霜霉病的基因由單一隱性基因控制。Van Vliet和Meysing（1974，1977）、Fanourakis和Simon（1987）則發(fā)現(xiàn)抗病品種Poinsett的抗性是由一個隱性單基因dm控制，并認為其與黃瓜抗白粉病的基因連鎖。孟攀奇等（2014）發(fā)現(xiàn)黃瓜對霜霉病的抗性是由單隱性基因控制，且感病性相對于抗性為不完全顯性。

由于黃瓜抗霜霉病性狀受環(huán)境、品種等多方影響，不確定因素多，研究難度大，因此其遺傳規(guī)律尚需進一步驗證。

5 黃瓜抗霜霉病相關基因的研究

國內(nèi)外學者采用多種手段對黃瓜抗霜霉病相關基因的定位、鑒定及功能分析進行了大量研究。Wan等（2010）采用抗病基因類似序列克隆和標記基因的策略，獲得了28個RGA片段，其中的CSRGA23在黃瓜葉片受到SA、ABA和H2O2等刺激物誘導或霜霉病菌侵染后，其表達量顯著高于對照組。李建吾等（2011）以黃瓜高抗自交系IL57為材料，利用抑制性差減雜交（SSH）技術構建了黃瓜抗霜霉病相關基因的正、反向差減文庫，并使用反向Northern斑點雜交技術進行篩選，獲得3個未知功能的抗病相關基因。劉大軍等（2013）利用擬南芥和甜瓜抗霜霉病蛋白質序列，通過生物信息學對候選基因進行分析，共獲得187個黃瓜抗霜霉病的候選基因，其中有2個與甜瓜抗霜霉病基因Atl和At2同源，屬eR基因，其余基因與擬南芥抗霜霉病基因同源，初步認定基因Csa001907和Csa002921為黃瓜抗霜霉病的R基因。Jin和Wu（2015）構建了兩個sRNA文庫，分別來自接種黃瓜霜霉病菌的葉片和未接菌的對照葉片，通過Solexa/Illumina系統(tǒng)進行測序分析，獲得42個在黃瓜霜霉病菌侵染葉片過程中差異表達的miRNA。

2009年以來，隨著黃瓜基因組測序工作相繼完成，為黃瓜抗病相關基因的深入研究打下了重要基礎。

6 展望

黃瓜霜霉病菌是一種專性寄生菌，難以在培養(yǎng)基上生長，給培養(yǎng)和保存帶來了極大困難，限制了不同地域菌株間的比較；另外，不同學者所采用的室內(nèi)、外接種方法和抗性鑒定均有差異。因此，下一步在深入研究黃瓜霜霉病菌的基礎上，加強國內(nèi)外的合作，建立標準化的抗性鑒定平臺，在限定溫度、濕度、光強、黃瓜生育期等環(huán)境條件下，建立一套輕簡化的抗病性鑒定體系和評價方法，可快速鑒定大量的品種資源，具有地域、品種資源間的廣適性、可比性和應用性。

目前，黃瓜霜霉病抗病基因存在單基因和多基因的不同結論，主要是與所采用的材料、接種霜霉病菌的小種、定位技術方法等因素不同有關。隨著測序技術、生物信息學和基因工程技術的發(fā)展和進步，黃瓜抗霜霉病的基因定位必將向著精細化、多基因準確聚合應用化方向發(fā)展，也必將提升抗性育種的水平和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

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（責任編輯 麻小燕）