牛角瓜大孢子與小孢子的發(fā)生發(fā)育觀察

賓珍蘭 湯丹峰 鄭杰 劉一丁 陳勵虹 周瑞陽

摘要：【目的】明確牛角瓜[Calotropis gigantea（Linn.） W. T. Aition]大孢子與小孢子的發(fā)生發(fā)育情況，為其耕作栽培學及植物學研究提供基礎資料，也為其遺傳育種研究及品種改良打下基礎?！痉椒ā坑谑⒒ㄆ诓杉煌l(fā)育時期的牛角瓜花蕾，運用石蠟切片技術觀察其大孢子與小孢子的發(fā)生發(fā)育特征?！窘Y果】牛角瓜大孢子與小孢子的發(fā)育時期與其花器官外部形態(tài)特征存在對應關系，雄蕊的發(fā)生發(fā)育早于雌蕊。牛角瓜小孢子黏連成塊狀結構，與普通植物的分散型小孢子形成鮮明對比，其小孢子母細胞發(fā)育為連續(xù)型，絨氈層細胞有3～4層，為腺質(zhì)絨氈層，單核期絨氈層細胞壁開始降解，花粉成熟后絨氈層細胞自溶。胚囊發(fā)育類型為蓼型，胚珠橫生，無珠被；四分體呈線型排列，成熟胚囊有次生核?！窘Y論】牛角瓜大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育與花器官外部形態(tài)大小密切相關，其結實率低并非雌性或雄性敗育所致。

關鍵詞： 牛角瓜；花粉塊；大孢子；小孢子；發(fā)生發(fā)育特征

中圖分類號： S567.239 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1658-06

0 引言

【研究意義】牛角瓜[Calotropis gigantea（Linn.） W. T. Aition]又名斷腸草、五狗臥花，屬蘿藦科常綠灌木，樹高可達3.0 m，全株富含乳汁，自然分布于熱帶和南亞熱帶地區(qū)，可在干熱河谷、沙漠化、鹽堿地、沙灘等荒地推廣種植。牛角瓜是一味傳統(tǒng)中藥，富含牛角瓜苷、強心苷和生物堿等有效成分，具有強心鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、抗癌等作用。牛角瓜纖維是牛角瓜種子上生長的附屬物，平均長度34.0 mm，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型可利用的植物纖維（方國平和胡惠民，2014），但牛角瓜存在大量落花現(xiàn)象，受精結實率極低，其纖維產(chǎn)量一般僅有75 kg/ha左右。因此，明確牛角瓜的生殖生長規(guī)律是其品種改良和高產(chǎn)栽培技術研究的關鍵。【前人研究進展】至今，已有較多關于牛角瓜纖維的研究報道。黃惠民（2009）通過對牛角瓜纖維進行特殊處理，最終得到可紡纖維，開啟了人們對牛角瓜利用的新認識，即牛角瓜纖維可作為一種新型的紡織原料。費魏鶴等（2011）對牛角瓜纖維結構進行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其具有纖維表面光澤度好、中空度大等顯著特點。高靜等（2013）對牛角瓜纖維的結構、性能進行測試，并與木棉、棉花纖維比較，認為牛角瓜纖維中空度高、相對密度小、色澤光亮、手感柔滑，是制作保暖、高檔紡織品的新型材料。李璇等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，牛角瓜纖維縱向和橫截面形態(tài)特征顯著，且纖維密度較小，紅外吸收光譜圖有特征峰，可區(qū)別于其他纖維。目前，牛角瓜主要采用播種繁殖。高柱等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，水浸催芽可提高牛角瓜種子萌發(fā)率，且秋季播種發(fā)芽率較春季高；劉鵬等（2014）研究表明，各施肥水平對牛角瓜苗高和地徑生長作用明顯，各營養(yǎng)元素對牛角瓜苗高、地徑生長的影響排序為N>P>K。牛角瓜開花數(shù)量多，但坐果率低，且產(chǎn)量低（魏靜等，2013），極大制約了牛角瓜纖維的開發(fā)與利用?！颈狙芯壳腥朦c】一般來說，影響植物結實率的因素諸多，主要包括外在環(huán)境因素和自身生殖特性因素兩大類。外部環(huán)境因素包含溫度、光照、水分、病蟲害等，自身生殖特性又分為有性生殖發(fā)育特性和傳粉生物學特性（何長征等，2008；周建梅等，2016）。在特定的外部環(huán)境條件下，了解其生殖生長情況，有助于找出結實率低的原因，為其品種改良、品種質(zhì)量和產(chǎn)量提高提供理論依據(jù)，但至今鮮見有關牛角瓜生殖生長方面的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】明確牛角瓜大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育與花器官外部形態(tài)大小的關系及其發(fā)育特征，為牛角瓜的耕作栽培學及植物學研究提供基礎資料，也為其遺傳育種研究及品種改良打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

牛角瓜由廣西藥用植物園提供，種植于廣西大學農(nóng)學院教學科研基地。

1. 2 試驗方法

于盛花期采集不同發(fā)育時期的花蕾，去除花冠，用游標卡尺按柱頭部位（包含柱頭與副花冠）大小進行分級取樣，圖1為白色花測量方式。不同分級各取10朵花蕾，用FAA固定液固定20 h后轉入70%乙醇，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。固定材料?jīng)70%、80%、85%、90%、95%和100%梯度酒精脫水后，TO透明劑透明、透蠟、包埋、切片（厚度10 μm），再以TO透明劑脫蠟、海氏蘇木精染色5 min、樹膠封片，Olympus BH-2型光學顯微鏡下觀察與攝影。

2 結果與分析

2. 1 雌、雄配子體發(fā)育時期與花器官外部形態(tài)特征的關系

牛角瓜花為兩性花，由形狀如小狗的五枚副花冠環(huán)繞柱頭，故又名五狗臥花，花藥繞生于柱頭周邊（圖1箭頭所示處），雄蕊的發(fā)生發(fā)育早于雌蕊，雄蕊發(fā)育的同時副花冠也在生長，副花冠與柱頭相對位置的變化見表1，其顏色發(fā)生變化，由白色漸變?yōu)闇\紫色到紫色（圖1），雄蕊成熟時花冠未開展?；ü陂_展后即成熟胚囊形成。

2. 2 小孢子發(fā)生與雄配子體的發(fā)育規(guī)律

小孢子母細胞比周圍的花粉囊壁細胞大，其細胞質(zhì)濃厚，細胞核大，核仁明顯（圖2-a），且不同切面呈不同狀態(tài)（圖2-b），之后小孢子母細胞體積繼續(xù)增大，進入減數(shù)分裂時期，可觀察到二分體、四分體結構分布在整個花粉囊室內(nèi)（圖2-c），隨后進入單核期（圖2-d），絨氈層細胞有3～4層，其細胞壁在單核靠邊期開始降解，小孢子間存在某種物質(zhì)能促使小孢子聚集成塊（圖2-e），在花粉成熟后絨氈層細胞自溶（圖2-f），成熟花粉粒排列緊湊，形狀各異，呈明顯的棱角狀（圖2-g）。

牛角瓜一般有4～5個花藥，每個花藥有兩個花粉囊，每個花粉囊形成1～2個花粉塊，多為1個。兩個相連花粉囊的花粉塊通過花粉塊柄連在一起（圖2-h），如昆蟲翅膀狀（圖2-i）?；ㄋ庨_裂處位于花粉塊柄生成處（圖2-h），花粉塊長約1.2 mm。

2. 3 大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育規(guī)律

2. 3. 1 大孢子的發(fā)生 牛角瓜花有兩枚心皮，離生（圖3-a）。子房腹縫線內(nèi)表皮局部細胞進行平周分裂和垂周分裂，形成突起，即胚珠原基，其胎座類型為邊緣胎座（圖3-b）。胚珠原基細胞經(jīng)分裂和分化后，朝向胎座的一端發(fā)育為珠柄，另一端發(fā)育為珠心組織。此時的珠心組織細胞分裂能力較強，且上端細胞的分裂速度與下端細胞分裂速度相同，胚珠直線生長。同時，珠心表皮下出現(xiàn)一個體積與細胞核皆比周圍珠心組織細胞大的細胞，即孢原細胞（圖3-c），孢原細胞開始分裂形成一個在縱軸方向明顯伸長的細胞，即大孢子母細胞。珠心表皮細胞與大孢子母細胞間含有2～3層細胞，即牛角瓜大孢子發(fā)育屬于厚珠心型（圖3-d）。隨后大孢子母細胞進入減數(shù)分裂時期，經(jīng)過第一次分裂產(chǎn)生二分體細胞（圖3-e），在此過程中胚珠各部位珠心組織細胞分裂速度并不一致，珠柄開始出現(xiàn)彎曲，隨后大孢子母細胞進入第二次分裂，產(chǎn)生4個大孢子，沿胚珠長軸方向排列形成線性四分體（圖3-f）。

2. 3. 2 雌配子體的發(fā)育 四分體形成后不久，珠孔端的3個大孢子會逐漸退化，近珠柄端的大孢子發(fā)育形成功能大孢子（圖4-a）。功能大孢子進行一次細胞內(nèi)核分裂，產(chǎn)生2個細胞核，即形成二核胚囊。2個細胞核間形成一個大液泡，使2個細胞核分別向胚囊的兩極移動（圖4-b）。2個細胞核分別在胚囊的兩端進行兩次核分裂，形成八核胚囊（圖4-c），之后兩極端各有一個細胞核向胚囊中間移動，形成中央細胞的極核，2個極核再進一步融合形成次生核（圖4-d），遠珠柄端剩余3個細胞核分別形成一個卵細胞和2個助細胞（圖4-d），而近珠柄端的3個細胞核形成反足細胞（圖4-e）。因此，牛角瓜雌配子體發(fā)育屬于蓼型。雌配子體發(fā)育過程中珠柄繼續(xù)彎曲，最后成熟胚珠為橫生胚珠（圖4-e），整個胚囊的發(fā)育過程未見珠被結構。

3 討論

絨氈層是花藥壁的最內(nèi)層，對花粉的發(fā)育起著重要作用。絨氈層通常為一層，少數(shù)植物為二層或多層，牛角瓜絨氈層為3～4層，與春蘭（Cymbidium goeringii）花藥壁為二層相似（胡適宜和楊堅，1989），可能與花粉塊的形成有關。腺質(zhì)絨氈層或稱分泌絨氈層，在花藥發(fā)育過程中腺質(zhì)絨氈層細胞壁自溶后所產(chǎn)生的原生質(zhì)體仍然能不同程度地維持原形，直到花粉成熟后，原生質(zhì)體完全自溶（武阿梅等，2008；肖玉菲等，2014）。原生質(zhì)體完全自溶前，首先是細胞壁溶解，在不同植物中細胞壁溶解的時期并不一致，番茄（Lycopersion esculentum）的細胞壁溶解是在小孢子母細胞時期（陳國菊等，1999），楸樹（Catalpa bungei）在四分體后才溶解（樊莉麗等，2011），虎榛子（Ostryopsis davidiana）在單核小孢子時期開始溶解（武阿梅等，2008）。本研究中，牛角瓜絨氈層為腺質(zhì)絨氈層，細胞壁溶解發(fā)生在單核期。

通常情況下，被子植物的小孢子在四分體形成后胼胝質(zhì)會消失，小孢子單粒散落，如煙草（Nicotiana rustica）（朱楠等，2014）、柴胡（Bupleurum Chinese）（王艷杰和申家恒，2007）、虎榛子（武阿梅等，2008）等，也有以四分體為單位的四合花粉，如春蘭（胡適宜和楊堅，1989）等。本研究中，牛角瓜花粉粒為無規(guī)則聚集形成花粉塊，且成熟花粉塊內(nèi)花粉粒壁厚度不一，與高斑葉蘭（Goodyera procera）（徐是雄等，1987）、春蘭（胡適宜和楊堅，1989）等蘭科植物相似。胡適宜和楊堅（1989）研究發(fā)現(xiàn)，在蘭科植物花粉塊形成過程中，其花粉塊成分含有孢粉素和纖維素，是由于四分體間有胞間連絲，存在聯(lián)結花粉粒的橋結構，或由花粉粒外壁的纖維狀物質(zhì)黏合作用而形成。至于牛角瓜花粉塊內(nèi)連接小孢子與小孢子間的物質(zhì)成分是什么，以及花粉粒間是如何作用形成花粉塊等問題，均需進一步探究。

整個牛角瓜胚囊發(fā)育過程未見珠被結構，屬于無珠被胚珠。此外，牛角瓜小孢子與大孢子發(fā)育過程正常，未發(fā)現(xiàn)敗育現(xiàn)象，說明其結實率低與雌性或雄性不育無關，可能與花粉結構或傳粉生物學特性有關，具體機理有待深入研究。

4 結論

牛角瓜大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育與花器官外部形態(tài)大小密切相關，其結實率低并非雌性或雄性敗育所致。

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（責任編輯 蘭宗寶）