甘蔗與斑茅割手密復(fù)合體的回交后代真實性鑒定及染色體遺傳分析

黃玉新 羅霆 高軼靜 張保青 周珊 楊翠芳 段維興 雷敬超 韋金菊 張革民 李楊瑞

摘要：【目的】掌握斑茅割手密復(fù)合體（簡稱斑割復(fù)合體）在雜交利用過程中的染色體遺傳規(guī)律，為斑割復(fù)合體適宜回交利用代數(shù)提供參考依據(jù)?！痉椒ā窟x用4對引物對甘蔗與斑茅割手密復(fù)合體的回交后代進行SSR標記鑒定，并利用甘蔗根尖細胞酶解去壁低滲法對真實雜種進行染色體數(shù)目觀察?！窘Y(jié)果】供試的28個雜交后代材料（15個GT05-164與GXASF108-2-28雜交BC1代，13個GT42與GXASBC112-A6-25雜交BC2代）均為真實雜種。選擇在2對SSR引物中均擴增出父本特征帶的后代（5個BC1代和7個BC2代）進行染色體觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個BC1代的染色體數(shù)目介于95～98條，其染色體按“n+n”方式傳遞；7個BC2代的染色體數(shù)目介于94～101條，其染色體也按“n+n”方式傳遞。【結(jié)論】甘蔗與斑割復(fù)合體雜交BC1和BC2代中染色體傳遞方式均為“n+n”，母本甘蔗的染色體未加倍，高貴化育種進程減慢，可能需要更高的雜交代數(shù)才能獲得聚集斑茅和割手密血緣的優(yōu)良品種（系）。

關(guān)鍵詞： 甘蔗；斑割復(fù)合體；雜交后代；SSR標記；染色體傳遞

中圖分類號： S566.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1642-06

0 引言

【研究意義】甘蔗（Saccharum officinarum）是禾本科高光效C4作物，也是全球性最高效的糖能兼用可再生能源作物（廖芩等，2015）。但由于長期的種間種內(nèi)近交，育成品種的生活力、適應(yīng)性、抗逆性、宿根性等普遍下降，致使甘蔗育種工作難以取得重大進展。甘蔗野生種質(zhì)斑茅和割手密具有抗逆性強、適應(yīng)性廣、多蘗、宿根性強等優(yōu)良特性（Piperidis et al.，2000）。斑茅割手密復(fù)合體（簡稱斑割復(fù)合體）為斑茅與割手密的屬間雜種，遺傳了雙親的優(yōu)點，且在長勢、綜合農(nóng)藝性狀及抗性上具有超親優(yōu)勢（高軼靜等，2012；劉昔輝等，2012a）。因此，開展甘蔗遠緣雜交工作，引進斑茅和割手密的優(yōu)異基因，既能豐富甘蔗品種的遺傳背景，又可有效提高育成品種的綜合水平?！厩叭搜芯窟M展】至今，國內(nèi)外已有關(guān)于甘蔗與其近緣野生種進行雜交利用的研究報道。林秀琴等（2013）利用基因組原位雜交技術(shù)（GISH）對滇蔗茅與熱帶種雜交F1代染色體組成進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜種F1代染色體以“n+n”方式進行傳遞，但由于滇蔗茅與熱帶種雜交F1代花粉高度不育，難以用作父本改良現(xiàn)有甘蔗品種，導(dǎo)致滇蔗茅種質(zhì)資源優(yōu)異基因的挖掘利用受到極大阻礙。王先宏等（2014）采用常規(guī)壓片法對甘蔗與蔗茅雜交F2BC1代的染色體數(shù)目進行傳遞分析，結(jié)果表明，在觀察的5個后代中體細胞染色體數(shù)目均不恒定，存在3～7條的變幅；F2代材料04/14的染色體遺傳方式為“2n+n”，而F2BC1代的染色體遺傳方式為“n+n”。Wu等（2014）、Huang等（2015）先后利用GISH探討斑茅染色體在雜交后代的遺傳模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分BC1材料中染色體以特殊的“2n+n”方式傳遞，而BC2、BC3代中的染色體以“n+n”方式傳遞?！颈狙芯壳腥朦c】根據(jù)前人的相關(guān)研究結(jié)果可知，盡管已獲得不少高世代的含斑茅或滇蔗茅血緣的材料，但至今未見有品種育成?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本課題組前期通過利用廣西斑割復(fù)合體GXAS07-6-1（2n=62）與甘蔗雜交，獲得一批經(jīng)分子標記鑒定為真實雜種且表現(xiàn)優(yōu)良的育種新材料（高軼靜等，2012；劉昔輝等，2012a；劉許輝，2013），其雜交后代的染色體基本按“n+n”方式傳遞，但不排除存在部分染色體加倍現(xiàn)象（黃玉新等，2016）。因此，有必要采用SSR標記對雜交BC1、BC2代進行真實性鑒定，并對部分真實雜種進行染色體觀察、計數(shù)，掌握斑割復(fù)合體在雜交利用過程中的染色體遺傳規(guī)律，為斑割復(fù)合體適宜回交利用代數(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料包括斑割復(fù)合體雜交利用過程中的2個世代（BC1、BC2）及其雙親（表1）。BC1代的母本為GT05-164（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所選育品系，不含斑茅血緣），父本為甘蔗與斑割復(fù)合體雜交F1代GXASF108-2-28（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所選育品系，含廣西斑茅GXA87-36和廣西割手密GXS79-9血緣），其染色體為98條（黃玉新等，2016）。BC2代的母本為GT42（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所選育品種，不含斑茅血緣），父本為BC1真實雜種GXASBC112-A6-25。

1. 2 SSR-PCR擴增

基因組DNA提取參考高軼靜等（2012）的SDS法，應(yīng)用SSR標記對雜交后代的真實性進行鑒定。SSR引物（表2）設(shè)計參考Cordeiro等（2000）、Oliveira等（2009）的研究方法，并委托上海捷瑞生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系20.0 μL，包括10×Buffer（含2 mmol/L MgCl2）2.0 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA樣品40 ng，Taq DNA聚合酶1 U，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物在7%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，硝酸銀染色觀察。

1. 3 雜交后代真實性鑒定

以親本DNA為模板，篩選出父母本間具有父本特征性條帶的引物對雜交后代進行真實性鑒定，當雜交后代擴增產(chǎn)物具有父本特征條帶，則判定為真雜種；如僅含有母本條帶而無父本特征帶的后代，是無法確定其真實性，還需采用其他引物進行鑒定。

1. 4 染色體觀察及計數(shù)

染色體玻片制備參考吳嘉云（2013）的方法。蔗莖在28 ℃恒溫保濕沙培條件下發(fā)根，長至1～2 cm時，于上午9：00～10：00（夏季）或11：00～11：30（冬季）選取幼嫩的根尖置于飽和對二氯苯水溶液中室溫處理3～5 h，以現(xiàn)配卡諾氏固定液4 ℃固定12 h以上，再經(jīng)0.075 mol/L KCl低滲處理1 h，于4 ℃下用70%酒精保存?zhèn)溆?。制片時，取出根尖用0.25 mol/L HCl酸解10 min，再轉(zhuǎn)移至混合酶液（纖維素酶∶果膠酶=3.50%∶1.75%）中37 ℃恒溫酶解約8 h。酶解后的根尖用火焰干燥法制片，以改良苯酚卡寶品紅染色后顯微鏡下觀察并拍照，選擇20個以上背景清晰、分散完整的染色體進行計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 GT05-164與GXASF108-2-28雜交BC1代的SSR鑒定結(jié)果

篩選出2對SSR引物對15個GT05-164與GXASF108-2-28雜交BC1代進行真實性鑒定，結(jié)果如圖1所示。引物ESTC64（左）共擴增出3條父本特征帶（箭頭所示），約位于180、430和560 bp處，12-A6-1、12-A6-3、12-A6-5、12-A6-16、12-A6-21、12-A6-28、12-A6-29等7個BC1代均能擴增獲得這3條父本特征帶及約位于210 bp處的父母本共有帶。引物ESTC78（右）共擴增出2條父本特征帶（箭頭所示），約位于145和210 bp處，12-A6-3、12-A6-4、12-A6-5、12-A6-9、12-A6-10、12-A6-14、12-A6-19、12-A6-20、12-A6-25、12-A6-27、12-A6-28、12-A6-29等12個BC1代均能擴增獲得1～2條父本特征帶及約位于170 bp處的父母本共有帶。綜合2對引物的擴增結(jié)果可知，15個BC1代均為真實雜種，其中12-A6-3、12-A6-5、12-A6-28、12-A6-29在2對SSR引物中均能擴增出父本特征帶。

2. 2 GT42與GXASBC112-A6-25雜交BC2代的SSR鑒定結(jié)果

篩選出2對SSR引物對13個GT42與GXASBC112- A6-25雜交BC2代進行真實性鑒定，結(jié)果如圖2所示。引物mSSCIR41（左）能擴增出5條父本特征條帶（箭頭所示），約位于170、180、220、500和550 bp處，15-461-3、15-461-5、15-461-7、15-461-9、15-461-11、15-461-12、15- 461-13、15-461-17等8個BC2代均能擴增出1條或1條以上的父本特征帶及約120 bp處的父母本共有帶。引物EST2-14（右）擴增出2條父本特征條帶（箭頭所示），約位于120和340 bp處。除15-461-9以外，其余12個BC2代均能擴增出1～2條父本特征條帶及約位于90、220和230 bp處的3條父母本共有帶。綜合2對引物的擴增結(jié)果可知，13個BC2代均為真實雜種，其中15-461-3、15-461-5、15-461-7、15-461-11、15-461-12、15-461-13、15-

461-17在2對SSR引物中均能擴增出父本特征帶。

2. 3 甘蔗×斑割復(fù)合體雜交BC1、BC2代染色體數(shù)目和傳遞方式推斷

選擇在2對SSR引物中均擴增出父本特征帶的后代（除12-A6-25外）進行染色體觀察，包括5個BC1代和7個BC2代，結(jié)果如圖3和表3所示。由表3可知，在5個BC1代組合中，親本及其子代的體細胞染色體數(shù)目均不恒定，變幅為6～9條。由于BC1代母本GT05-164的染色體為104條（眾數(shù)，下同），父本GXASF108-2-28的染色體為98條，雙親的配子體染色體數(shù)目之和為101條，5個BC1代的染色體數(shù)目介于95～98條，故推測甘蔗與斑割復(fù)合體雜交BC1代染色體基本按“n+n”方式傳遞。在7個BC2代組合中，親本及其子代的體細胞染色體數(shù)目也均不恒定，變幅為4～10條。母本GT42的染色體為107條，父本GXASBC112-A6-25的染色體為96條，雙親的配子體染色體數(shù)目之和為102條，7個BC2代的染色體數(shù)目介于94～101條，由此推測甘蔗與斑割復(fù)合體雜交BC2代染色體也基本按“n+n”方式傳遞。

3 討論

雜交后代真實性鑒定是利用甘蔗野生種質(zhì)拓寬遺傳基礎(chǔ)進行種質(zhì)創(chuàng)新研究的根本。目前用于雜種真實性鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)、同工酶及分子標記等方法（黃家雍等，1997；劉文榮等，2004；鄭雪芳等，2004）。SSR標記為共顯性標記，其操作簡單、重復(fù)性好、結(jié)果可靠，是雜種真實性鑒定的有效手段（陰云伙等，2015；張恩慧等，2016）。桃聯(lián)安等（2009）對20個云南割手密82-114種間雜交后代進行鑒定，利用2對SSR引物鑒定出15個真實雜種；劉昔輝等（2012b）研究表明，SSR標記可用于甘蔗與河八王屬間雜種的真實性鑒定；陸鑫等（2012）對熱帶種與滇蔗茅遠緣雜交F1代進行SSR鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鑒定的62個F1代均為真實雜種，所選用的4對引物表現(xiàn)出較高的鑒定效率。本研究利用SSR標記對甘蔗與斑割復(fù)合體雜交BC1、BC2代進行真實性鑒定，每個組合篩選出父本特征帶清晰且多態(tài)性豐富的2對引物進行鑒定，結(jié)果表明，供試的28個雜交后代均為真實雜種，其中部分材料在2對引物中均能擴增出父本特征帶，鑒定效率較高。

由于甘蔗為異源多倍體物種，遺傳背景較復(fù)雜（楊翠鳳等，2015），染色體傳遞方式有多種形式，且減數(shù)分裂過程染色體不能正常配對，會產(chǎn)生不平衡配子，造成同一親本組合后代染色體數(shù)目并不完全不一致。本研究對5個BC1代和7個BC2代進行染色體觀察，結(jié)果表明，甘蔗與斑割復(fù)合體雜交BC1、BC2代染色體數(shù)目分別為95～98和94～101條，而雙親各自單倍的配子體染色體數(shù)目之和分別為101和102條，染色體基本按“n+n”方式傳遞，但同時存在部分染色體丟失現(xiàn)象。

在甘蔗的高貴化育種過程中，染色體傳遞方式為“2n+n”，雜種后代獲得母本熱帶種的全套染色體，其高糖的特性得以穩(wěn)定遺傳，同時獲得父本野生種的一半染色體，經(jīng)過多次回交，野生種血緣不斷減少，不良特性也隨之減少，因此，能夠快速選育出高產(chǎn)、高糖、抗性好的材料。Wu等（2014）對斑茅染色體遺傳的研究發(fā)現(xiàn)，在觀察的13個BC1代中有4個后代遺傳方式為“2n+n”，但這4個BC1代來自兩個不同親本組合，由此表明“2n+n”的傳遞方式并不限于個別植株。本研究僅觀察了5個BC1代和7個BC2代，且均來自一個親本組合，如觀察更多的組合或斑割復(fù)合體與不同甘蔗進行正反交是否也會存在“2n+n”遺傳方式，尚有待進一步探究。

4 結(jié)論

甘蔗與斑割復(fù)合體雜交BC1和BC2代中染色體傳遞方式均為“n+n”，母本甘蔗的染色體未加倍，高貴化育種進程減慢，可能需要更高的雜交代數(shù)才能獲得聚集斑茅和割手密血緣的優(yōu)良品種（系）。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）