雨生紅球藻中蝦青素的檢驗(yàn)及應(yīng)用的研究進(jìn)展

肖麗恒

DOI：10.16660/j.cnki.1674-098X.2016.18.063

摘 要：目的 薄層層析法和高效液相法兩種分離方法在雨生紅球藻中提取所得到的總類胡蘿卜素來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。方法 通過TLC法檢測(cè)蝦青素成分，通過HPLC法C18柱對(duì)蝦青素中的各組分進(jìn)行了準(zhǔn)確分析和鑒定。結(jié)果 TLC檢測(cè)蝦青素成分發(fā)現(xiàn)，由于正己烷與丙酮的比例不同，會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的胡蘿卜素薄層層析效果產(chǎn)生很大影響；展開時(shí)間10 min后，在蝦青素的粗體物質(zhì)中，其分離效果最佳，時(shí)間在10 min后繼續(xù)延續(xù)就會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。HPLC檢測(cè)蝦青素濃度曲線實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)方程式精確快捷地測(cè)出了各種游離蝦青素的濃度，當(dāng)這個(gè)系數(shù)在0.99以上時(shí)，證明它們有良好的聯(lián)系。結(jié)論 對(duì)蝦青素TLC的展開效果影響較大的一個(gè)因素就是正己烷與丙酮不同比例配比；對(duì)展開時(shí)間影響蝦青素薄層層析效果的探究中得知：當(dāng)展開時(shí)間是10 min時(shí)，各成分的分離效果最佳。該文研究所得的結(jié)果及數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中的報(bào)道大致一樣。

關(guān)鍵詞：雨生紅球藻 蝦青素 檢驗(yàn) 色譜法

中圖分類號(hào)：TS254.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2016）06（c）-0063-02

薄層色譜（Thin Layer Chromatography，TLC），又叫作薄層層析，屬于固-液吸附色譜的一種，經(jīng)常被用來(lái)做類胡蘿卜素的分離純化。這種方法就是在涂有硅膠薄層的玻璃板上點(diǎn)樣品，再通過正己烷和丙酮的混合溶劑展開分離之后，可以看出：在硅膠薄層上，從雨生紅球藻中提取的類胡蘿卜素樣品呈帶狀分布。當(dāng)硅膠板上的類胡蘿卜素進(jìn)行有效分離時(shí)，因不同類的胡蘿卜素其末端基因的差異，從而導(dǎo)致產(chǎn)生不同的色譜行為，隨著不同速率的展開劑的應(yīng)用差別，從而分離開不同的組分。

高效液相色譜法（HPLC）能對(duì)蝦青素中的各組分含量予以高效、精準(zhǔn)的分析，其分析的原理就是根據(jù)樣品中不同組分，在固定相和流動(dòng)相間的重復(fù)多次平衡分配，通過分配中產(chǎn)生的微小差別來(lái)達(dá)到分離的目的?？梢岳脮r(shí)間來(lái)表示樣品中的各組分在色譜柱內(nèi)的滯留能力，這屬于色譜定性的根本依據(jù)。色譜柱是整個(gè)系統(tǒng)中的核心組成部分，在其中進(jìn)行HPLC的分離過程，文章通過C18柱對(duì)蝦青素中的各組分進(jìn)行了準(zhǔn)確分析和鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)材料

根據(jù)實(shí)現(xiàn)和查閱相關(guān)資料及文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，在提取蝦青素時(shí)，用丙酮作為提取溶劑，對(duì)蝦青素酯的皂化效果會(huì)有一定的影響。而且在通過HPLC進(jìn)行分析時(shí)，還會(huì)有倒峰出現(xiàn)，所以，在文中，提取蝦青素所用的溶劑是乙酸乙酯與乙醇（v/v，2/1）的混合溶劑。

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

1.1.1 試劑

實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑有：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)的純度95.2%的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品、上海埃彼化學(xué)試劑生產(chǎn)的正己烷（AR）、無(wú)水乙醇（AR）、三氯甲烷（AR）以及國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)的甲醇（色譜純）試劑。

1.1.2 材料

文章中用到的主要材料有青島長(zhǎng)揚(yáng)化工公司生產(chǎn)的規(guī)格為20 mm×75 mm的CF254硅膠板以及規(guī)格為0.5 mm的玻璃毛細(xì)管點(diǎn)樣管。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

此文試驗(yàn)應(yīng)用到的主要儀器設(shè)備由上海滬西儀器公司及上海華美公司提供。主要儀器有層析缸、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵、恒流泵以及高效1260型液相色譜儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

TLC法檢測(cè)蝦青素成分，具體如下。

（1）硅膠板的活化。

硅膠吸附劑的顆粒外表面或它的多孔結(jié)構(gòu)里，孔的外表面既能夠吸附物質(zhì)，也可以可逆地吸附水分，但如果吸附了水分，它對(duì)其他物質(zhì)的吸附能力就隨之有所降低，所以，吸附劑吸附能力的高低取決于它吸附了多少水分?；罨傅木褪枪枘z在一定溫度下烘烤，把吸附的水分除去?；谖墨I(xiàn)，選擇在溫度為100 ℃下活化1 h。

（2）最佳展開劑的確定。

把正己烷與丙酮的混合液作為TLC的展開劑，并對(duì)這兩者因配比不同影響TCL效果進(jìn)行研究，最終選擇最好的展開劑。把正己烷與丙酮之間的體積比分別設(shè)定為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4，再通過不同的展開效果來(lái)確定最好的展開劑。

（3）薄層層析操作方法。

把標(biāo)準(zhǔn)品（作為對(duì)照）和需要分析的各樣品分別點(diǎn)在經(jīng)過活化的硅膠板上，將所有點(diǎn)定在同一個(gè)位置上，并記至硅膠板的表面時(shí)，將硅膠板取出，記錄下展開劑液面和樣品中的各個(gè)組分在硅膠板上的位置，再測(cè)出原點(diǎn)與斑點(diǎn)和展開劑前沿之間的距離，用高扭矩以下的公式來(lái)計(jì)算Rf值。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLC檢測(cè)成分

對(duì)硅膠板進(jìn)行活化，由于正己烷與丙酮的比例不同，這就會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的胡蘿卜素薄層層析效果產(chǎn)生很大影響，當(dāng)兩者的體積比是7∶3的時(shí)候，此時(shí)分離的蝦青素顯現(xiàn)出的效果是最佳的，此時(shí)，Rf的標(biāo)準(zhǔn)值是0.22，且樣品中的每種成分的Rf值都不相同，這樣就能夠較好地把其中4種不同的成分分離開。再把樣品通過與硅膠板位置進(jìn)行比較，可知，游離蝦青素和標(biāo)準(zhǔn)樣品在同一條直線上的顏色最淡，再通過蝦青素中不同成分的不同含量和各個(gè)位置顏色的濃淡程度，就可以得出，游離蝦青素點(diǎn)上，顏色最濃的點(diǎn)就是蝦青素單酯，其次，顏色較淡的點(diǎn)就是蝦青素雙酯，因沒有對(duì)照品，最上面的成分暫時(shí)不能確定。在裝有展開劑的密閉層析缸中放入經(jīng)過點(diǎn)樣處理過后的硅膠板，因色素不同，樣品點(diǎn)上出現(xiàn)的色素帶就不同，當(dāng)展開時(shí)間不在一定范圍內(nèi)的時(shí)候，就會(huì)出現(xiàn)一種叫拖尾的現(xiàn)象，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)所使用的展開劑和條件下，展開時(shí)間10 min后，在蝦青素的粗體物質(zhì)中，其分離效果最佳，時(shí)間在10 min后繼續(xù)延續(xù)就會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

2.2 HPLC檢測(cè)成分

為了使得對(duì)游離蝦青素濃度的檢測(cè)方便快捷，以下做了一個(gè)關(guān)于游離蝦青素濃度和HPLC峰面積圖表來(lái)建立起了它們之間的一個(gè)方程式，這樣就可以精確、快捷地測(cè)出各種游離蝦青素的濃度，如圖1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)游離蝦青素的濃度范圍是0～15 mg/L時(shí)，它們基本保持呈直線的趨勢(shì)，其方程式是：8983.2+239923x=y，在這當(dāng)中，x表示游離蝦青素的濃度（mg/L），y表示HPLC的峰面積；與之相關(guān)聯(lián)的系數(shù)R2為0.9988。當(dāng)這個(gè)系數(shù)在0.99以上時(shí)，證明它們有良好的聯(lián)系，這個(gè)方程可以使用來(lái)定量分析游離蝦青素的濃度。

通過游離蝦青素的實(shí)驗(yàn)條件下，可以保留大概5.5 min，在提取品中發(fā)現(xiàn)的游離蝦青素含量較少，這是由于提取品中的蝦青素波峰很小。隨著提取的進(jìn)程，后面出現(xiàn)了比較明顯的波峰，通過分析其結(jié)果，說明這兩個(gè)較大的波峰是蝦青素單酯與蝦青素雙酯。

通過計(jì)算蝦青素提取品中各種物質(zhì)的峰面積，就可以得出，游離蝦青素占所提取的總類胡蘿卜素的5.6%，蝦青素單酯占67.5%，蝦青素雙酯占12.6%，其他成分為14.8%，這與文獻(xiàn)中的報(bào)道數(shù)據(jù)大致是相同的。

3 蝦青素的分離純化及應(yīng)用

在雨生紅球藻中，蝦青素大多是以酯的形式存在，不過由于在蝦青素酯的組成中，其脂肪酸有很多種類，它們的構(gòu)成也非常復(fù)雜多樣，幾乎沒有任何對(duì)照品，加上其他類胡蘿卜素的干預(yù)，導(dǎo)致很難對(duì)蝦青素的分離純化以及定量定性分析。所以，在此實(shí)驗(yàn)中，通過皂化法把不相同的蝦青素酯變?yōu)橛坞x蝦青素，通過HPLC，就能精準(zhǔn)測(cè)量出蝦青素的含量了。此章節(jié)主要改進(jìn)一些對(duì)皂化產(chǎn)生影響的條件，已達(dá)到在不影響蝦青素本身性質(zhì)的前提下來(lái)迅速有效地對(duì)蝦青素酯進(jìn)行皂化的目的。

經(jīng)過皂化處理之后的蝦青素粗提取品，主要就是游離蝦青素。但依然會(huì)有其他少量色素存在，這些少量色素的來(lái)源大概是：其中一部分來(lái)源可能是游離蝦青素的降解，另一部分可能來(lái)于原料中少量的其他類別的胡蘿卜素（比如β-胡蘿卜素、葉黃素以及其他色素等）。若還要對(duì)游離的蝦青素和其他成分做進(jìn)一步分離，就要對(duì)樣品進(jìn)行柱層析分離等步驟。柱層析的建立是基于在混合物中，不同組分在其物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的不同點(diǎn)上的，這些性質(zhì)的不同使其分離時(shí)間產(chǎn)生差異，這樣就達(dá)到了分離的目的。這種方法操作比較簡(jiǎn)捷，分離純度也很高，不需要很貴的一些器材，所以，這種方法在蝦青素的分離中得到了廣大應(yīng)用。它不同于紙層析、薄層層析的特點(diǎn)就是它可以在工業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模分離中使用。

4 結(jié)語(yǔ)

文章重點(diǎn)通過薄層層析法和高效液相法兩種分離方法，對(duì)雨生紅球藻中提取所得到的總類胡蘿卜素來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，得出以下結(jié)論。

（1）蝦青素TLC的展開效果影響較大的一個(gè)因素就是正己烷與丙酮不同比例配比，正己烷與丙酮之間的最佳配比（體積比）是7∶3。把正己烷：丙酮（v∶v，7∶3）的混合溶劑作為展開劑的時(shí)候，游離蝦青素的Rf值是0.21，而且，各個(gè)樣品中各種成分的Rf值是顯然有較大差異的，這樣就能夠使得各種組分可以有效地分離開。

（2）在對(duì)展開時(shí)間影響蝦青素薄層層析效果的探究中得知：當(dāng)展開時(shí)間是10 min的時(shí)候，每一種成分的分離效果是最佳的。

（3）用薄層層析法對(duì)雨生紅球藻中提取的總類胡蘿卜素進(jìn)行檢測(cè)得知：蝦青素單酯和雙酯是總類胡蘿卜素的主要成分，含有少量蝦青素和其他成分。

通過HPLC對(duì)蝦青素粗提取品的檢測(cè)結(jié)果得知：游離蝦青素在總類胡蘿卜素的5.6%，蝦青素單酯占67.3%，蝦青素雙酯占12.5%，其他成分為14.6%，與文獻(xiàn)中的報(bào)道大致一樣。

參考文獻(xiàn)

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