靈芝連作障礙土壤中的優(yōu)勢微生物種群對靈芝菌絲體的化感作用

馬紅梅 陳大雄 陳永敢

摘 要 通過對峙平板培養(yǎng)測定靈芝連作土壤中的優(yōu)勢微生物種群對靈芝菌體生長的化感效應(yīng)。結(jié)果表明：細(xì)菌和霉菌對靈芝的化感效應(yīng)差異達(dá)到了顯著水平（p<0.05），其中化感效應(yīng)最強(qiáng)的為細(xì)菌中的梭桿菌屬、分支桿菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬，三者的化感效應(yīng)值分別為-0.844 0、-0.866 6和-0.866 6，其次為霉菌中的青霉屬、木霉屬、鏈孢霉及曲霉屬，其化感效應(yīng)值分別為-0.666 7、-0.755 6、-0.555 6和-0.555 6；鏈霉菌屬的化感效應(yīng)差異不明顯（p<0.05）。此結(jié)果為靈芝連作障礙土傳病害的控制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 靈芝；微生物種群；對峙平板；化感效應(yīng)

中圖分類號 S567.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Alelopathic Effect of Dominant Microflora on Its

Mycelium of Continuous Cropping Obstacles

Ganoderma lucidum in Field Cultivation

MA Hongmei， CHEN Daxiong， CHEN Yonggan

College of Tropical Biology and Agronomy， Hainan Tropical Ocean University， Sanya， Hainan 572022， China

Abstract The allelopathic effect of the dominant microflora in continuous cropping obstacles soil on Ganoderma lucidum（G.L） Mycelium.growth were tested by dual culture on the PDA plate. The results showed that the allelopathic effect of molds and bacteria on the growth of G.L. had significant difference（p<0.05）. Clostridium， Mycobacterium， Alcaligenes sp. in bacteria had a stronger allelopathic effect on G.L obviously on the same plate， and the response indice on G.L mycelium was -0.844， -0.866 6 and -0.866 6， respectively， followed by all kind of dominant molds in continuous cropping soil； the response indices of Penicillium， Trichoderma， Neurospora and Aspergillus， on G.L. was -0.666 7， -0.755 6 and double -0.555 6， respectively. The allelopathic effect of Streptomyces had no significant differences. The results provided a theoretical basis for the control of soil borne disease in the continuous cropping of G.L.

Key words Ganoderma lucidum；Microflora；Flat confrontation；Aallelopathic effect

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.025

靈芝是一種藥食兩用的珍貴食用菌，隨著靈芝在醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用的不斷探索，人們對于靈芝的需求量也越來越大，野生的靈芝已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足人們的需求，人工種植的靈芝作為一種新興的種植產(chǎn)業(yè)出現(xiàn)，以滿足人們需求成為必然的選擇。隨著靈芝栽培面積的擴(kuò)大，靈芝栽培開始出現(xiàn)類似于其他作物連作障礙的問題[1]，主要表現(xiàn)為靈芝脫袋覆土連續(xù)種植后，其產(chǎn)量和品質(zhì)出現(xiàn)大幅度的下降，同時病害的發(fā)生也越來越頻繁[2]，通過常規(guī)培養(yǎng)料配方的篩選[3]、栽培品種的選擇[4]、加強(qiáng)栽培環(huán)境的管理等措施都很難提高靈芝的產(chǎn)量和質(zhì)量[5]，不得不丟棄原有的栽培地，尋找新的靈芝栽培地，極大地浪費(fèi)了土地資源，影響了靈芝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

作物發(fā)生連做障礙的主要因素包括：土壤營養(yǎng)失衡、作物自毒機(jī)理、作物殘?jiān)鼘ζ渖L發(fā)育的影響及土壤微生態(tài)環(huán)境惡化[6-8]。目前，對連作障礙的研究主要集中在根際土壤的研究方面，由于植物根系分泌物包含著植物對環(huán)境變化的響應(yīng)信息，所以備受關(guān)注。然而根系土壤中不僅只有植物根系生長過程中分泌的物質(zhì)，還有活躍的微生物種群[9]。研究微生物或植物對環(huán)境中其它微生物或植物產(chǎn)生的直接或間接的有利或不利的作用即為化感作用[10]，其中植物的化感作用研究最為活躍，研究的關(guān)鍵內(nèi)容是化感物質(zhì)的釋放機(jī)制問題[11]。然而植物研究的重要屏障之一是缺乏對微生物在化感作用中地位和作用的了解，因?yàn)橹参镏g、植物與微生物之間的化感作用多數(shù)也必須通過土壤微生物參與解毒或增強(qiáng)毒性[11]，缺乏微生物對植物的化感作用研究就無法確定化感作用在自然條件下所起的作用，因此，研究土壤微生物對植物的化感作用很有必要。

本研究在前期分離鑒定靈芝連作覆土土壤微生物的基礎(chǔ)上，分別測定了連作障礙土壤中的優(yōu)勢微生物種群與靈芝菌絲體之間的化感作用，以期從微生態(tài)化感作用的角度揭示靈芝栽培連作障礙的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

供體：化感作用供體靈芝菌種為瓊州學(xué)院靈芝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存的菌絲體（G. lucidum. sp）；受體：化感作用受體微生物菌株為我院靈芝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自靈芝連作2 a的土壤中分離[12]。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用對峙平板培養(yǎng)法測定靈芝菌體與土壤微生物之間的化感作用[13]：采用直徑為5 mm的打孔器將事先活化的靈芝及供試菌菌落均勻打上孔洞，制成5 mm的菌餅，靈芝菌餅置于9 cm的PDA平板中央，供試的微生物菌餅置于平板的邊緣，與靈芝菌餅距離25 mm，每個處理做3個重復(fù)，對照僅接靈芝菌餅，接種后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，3 d后開始觀測靈芝菌體、各個供體微生物菌株及空白未接供試菌株的生長情況。

1.2.2 化感效應(yīng)計(jì)算 按照Wiliamson[14]提供的方法計(jì)算化感作用大小-化感效應(yīng)系數(shù)值（Response Indices， RI），其中C和T分別代表：對照值和處理值。

1-C/T，T≥C；

RI=

T/C-1，T當(dāng)RI>0時表現(xiàn)為促進(jìn)作用，RI<0時為抑制作用，RI絕對值等于作用強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用WPS表格對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析，方差分析采用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌與靈芝菌絲體間的化感作用

靈芝連作覆土土壤中的優(yōu)勢霉菌主要為毛霉屬、曲霉屬、木霉屬、青霉屬及鏈孢霉屬[12]，其對靈芝菌絲生長的影響見圖1，各菌屬與靈芝間的化感效應(yīng)見表1。

由圖1可知，空白對照組的靈芝在第6天已經(jīng)長滿平板，5個霉菌處理的實(shí)驗(yàn)組的靈芝生長速度明顯慢于空白組，其中毛霉和曲霉實(shí)驗(yàn)組的靈芝7 d后長滿平板，而木霉、青霉、鏈孢霉實(shí)驗(yàn)處理組的靈芝無法長滿平板，最終枯死。

由表1可知，5種霉菌對靈芝生長的化感效應(yīng)表現(xiàn)為抑制作用，其中對靈芝抑制作用最強(qiáng)的是木霉屬和青霉屬，RI值分別為0.755 6和0.666 7；作用強(qiáng)度較小的是毛霉屬，化感受效應(yīng)值為0.377 8；鏈孢霉屬的作用強(qiáng)度跟曲霉屬的化感效應(yīng)值相等，均為0.555 6。

2.2 放線菌與靈芝菌絲體間的化感作用

靈芝連作覆土土壤中的優(yōu)勢放線菌主要為鏈霉菌屬中的白色類群、灰燼類群、褐色類群，其對靈芝菌絲生長的影響見圖2，各菌屬與靈芝間的化感效應(yīng)見表2。

由圖2可知，白色和褐色類型的實(shí)驗(yàn)組中的靈芝生長速度并未受到影響，實(shí)驗(yàn)組上面的靈芝菌落跟空白對照組的靈芝菌落幾乎同時長滿平板，灰燼類型對靈芝的生長具有影響，但影響結(jié)果較小。

由表2可知，鏈霉菌屬中的白色類群與褐色類群的差異不顯著（p<0.05），其RI值均為0.000 1，幾乎不影響靈芝菌的生長。鏈霉菌屬中的灰燼類型對靈芝菌絲體生長有較小的影響，在一定程度上影響靈芝菌落向著放線菌菌落擴(kuò)展的速度，但化感系數(shù)RI值僅為-0.033 3，其作用結(jié)果幾乎可以忽略不計(jì)。

2.3 細(xì)菌與靈芝菌絲體間的化感作用

靈芝連作覆土土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌主要為梭桿菌屬、不動桿菌屬、分支桿菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬，其對靈芝菌絲生長的影響見圖3，各菌屬與靈芝間的化感效應(yīng)見表3。

由圖3可知，不動桿菌屬、短桿菌屬、及芽孢桿菌屬的培養(yǎng)基上面的靈芝長滿平板的時間雖然比空白對照組靈芝慢，但實(shí)驗(yàn)組靈芝生長速度對比空白組靈芝的生長速度并沒有明顯的降低，并且能夠完成對平板上細(xì)菌菌落的覆蓋生長，這3種細(xì)菌的存在雖然在培養(yǎng)的前期能夠抑制靈芝的生長，但影響結(jié)果較小；梭桿菌屬、分支桿菌屬及產(chǎn)堿桿菌屬對靈芝的生長抑制作用較強(qiáng)。在第6天，當(dāng)空白組長滿平板時（直徑為9 cm），實(shí)驗(yàn)組靈芝菌落不足15 mm。

由表3可知，6種細(xì)菌對靈芝的化感效應(yīng)差異達(dá)到了顯著水平（p<0.05），其中對靈芝抑制作用較強(qiáng)的細(xì)菌為梭桿菌屬、分支桿菌屬及產(chǎn)堿桿菌屬，生長很快，三者對靈芝的化感效應(yīng)值分別為-0.844 0、-0.866 6和-0.866 6；細(xì)菌中的不動桿菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬對靈芝菌體的抑制作用較小，三者對靈芝的化感效應(yīng)值分別為-0.188 8、-0.055 5和-0.100 0。

3 討論與結(jié)論

在生產(chǎn)實(shí)踐中，食藥兩用菌連續(xù)栽培出現(xiàn)產(chǎn)量和品質(zhì)的下降后多歸結(jié)為生產(chǎn)管理不當(dāng)，導(dǎo)致病菌增多，但改善生產(chǎn)管理后，仍不見產(chǎn)量提升，致使栽培靈芝經(jīng)常換地，但鮮有報導(dǎo)從化感作用的角度研究靈芝連作的問題。已有的化感作用研究對象多為植物，有關(guān)食用菌的化感作用研究較少，特別是有關(guān)食用菌與栽培連作土壤微生物間的化感作用的研究鮮有報導(dǎo)。

靈芝子實(shí)體像植物，但卻沒有植物的根，屬于真菌，雖然連作障礙的發(fā)生機(jī)制可能跟其他的根際植物不同，但對于真菌類種植連作障礙機(jī)制的研究結(jié)果表明，覆土土壤微生物種群仍是影響連作障礙的重要因素[12]。

本研究結(jié)果表明，在連作優(yōu)勢土壤微生物種群中，細(xì)菌和霉菌均對靈芝菌絲體的生長具有一定影響，其中細(xì)菌中的產(chǎn)堿桿菌屬、梭桿菌屬、分支桿菌屬對靈芝菌體的化感抑制作用強(qiáng)度較高，其抑菌方式主要是借助較快的生長速度在平板上形成霜層，這與大部分細(xì)菌對于食用菌的生長顯示為抑制作用的研究結(jié)果一致[15]。真菌微生物中對靈芝抑制作用最明顯的是木霉屬，青霉屬和鏈孢霉屬次之。木霉屬真菌對食用菌的抑制機(jī)理主要通過侵染同一平板寄主，奪取寄主營養(yǎng)最終殺死寄主，同時還可通過揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質(zhì)同時作用的方式抑制同一平板食用菌的生長[16-17]；青霉和鏈孢霉真菌的主要抑制形式則是通過分泌有毒物質(zhì)形成的霉層，逐步侵蝕食用菌菌落，最終殺死寄主[18-19]。本研究結(jié)果證明靈芝在與木霉屬、青霉和鏈孢霉的對峙培養(yǎng)中最終枯死。由此可見，靈芝連作覆土微生物種群中的優(yōu)勢霉菌和某些細(xì)菌是靈芝連作中的土傳病原菌，是靈芝連作障礙的重要因素之一。

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