輻射誘發(fā)蘭花葉藝突變體的葉片葉肉細胞超微結構觀察

蘇暢 李枝林 李夏媛 王玉英

摘 要 以未經(jīng)輻射的全綠植株（TRIR-1）和經(jīng)輻射誘發(fā)葉藝蘭植株（TRIR-2）的葉肉細胞為試材，對其全綠植株葉片的正常綠色區(qū)、輻射誘變植株葉片的綠色區(qū)（TRIR-2′）和白色區(qū)（TRIR-2″）葉片葉肉細胞進行細胞超微結構觀察。結果表明：（1）TRIR-1葉肉細胞中葉綠體數(shù)量最多，TRIR-2′次之，TRIR-2″中無成熟完整的葉綠體；（2） TRIR-1葉肉細胞中的線粒體呈橢圓顆粒狀，TRIR-2′中的線粒體外膜破裂、線粒體溶解、嗜鋨顆粒數(shù)量最多，TRIR-2″中有少量外膜完整的線粒體；（3）TRIR-2″部分葉肉細胞中無細胞器，只有少量細胞質。說明經(jīng)輻射誘變葉藝蘭與未經(jīng)輻射植株葉肉細胞結構存在差異。

關鍵詞 黃色素花虎頭蘭 ；黃蟬蘭 ；葉肉細胞 ；超微結構 ；葉綠體 ；線粒體 ；輻射誘變

分類號 S682.31 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.03.006

Abstract The test materials of this study are mesophyll cells which take from cymbidium without induced by irradiation （TRIR-1） and new mutants induced by irradiation （TRIR-2）， including normal green area from TRIR-1 and both green area （TRIR-2′） and the white area （TRIR-2″） from TRIR-2. Ultrastructure of mesophyll cells were observed by Transmission Electron Microscope （TEM）. The results showed that： （1） In the mesophyll cells， the quantity of chloroplasts in TRIR-1 was the most， the quantities of chloroplasts in TRIR-2′ and TRIR-2″ were less. There are not even a little bit mature and complete chloroplast in the mesophyll cells of TRIR-2″； （2） The mitochondria in cell of TRIR-1 showed ellipsoid，mitochondrial membrane ruptured and mitochondria dissolved in TRIR-2′ the content of osmophilic gramules is the most in the cell of TRIR-2′， a small amount mitochondria with intact membrane appeared in TRIR-2″； （3） There is nothing but a few cytoplasm in some cell of TRIR-2″. This shows that some difference between the cymbidium without induced by irradiation and new mutants induced by irradiation in cell ultrastructure.The result can provide evidence for variety breeding of Cymbidium with verge line pattern lives.

Keywords Cymbidium tracyanum ； Cymbidium iridioides D. Don ； mesophyll cells ； ultrastructure ；chloroplast ； mitochondrion ； radiation mutagenesis

蘭花是中國傳統(tǒng)名貴花卉。葉藝蘭（線藝蘭）是指蘭屬（Cymbidium）植株葉片上鑲嵌著或金黃、或銀白、或濃綠、或朱紅、或墨黑的嘴、邊、點、線、斑的中國蘭統(tǒng)稱[1]。葉藝蘭栽培已有千年，因其葉片艷麗，形態(tài)優(yōu)美，被譽為“花中君子”，是珍貴的觀賞花卉[2]。葉（線）藝品種以墨蘭最多，劍蘭次之，春蘭、蕙蘭與寒蘭較少[3]。藝象主要表現(xiàn)為：金棱邊類、綠藝類、先明后暗類（全斑類）、鉗帽子類、爪藝類、水晶類、斑縞類（現(xiàn)明，后明）、棒縞類（現(xiàn)明，后明）、圖斑藝類、虎（豹）斑類等[4]。

輻射誘變育種是一種常用的育種方法，具有創(chuàng)造多種突變體、豐富種質資源庫，打破基因連鎖、提高重組率，保持優(yōu)良性狀、改良品種的某些不良性狀，以及突變性狀穩(wěn)定快、縮短育種年限等特點，γ射線仍是植物誘變育種中最常用的輻射誘變因素[5]。彭綠春等應用60Coγ射線處理碧玉蘭、西藏虎頭蘭、冬鳳蘭、竹葉蘭的組培苗，獲得了植株矮化、變粗、葉變寬、葉上有淡綠斑等較明顯的表型變化[6]，蔣彧等用60Coγ輻射蘭花春劍隆昌素根狀莖，分化苗的主要變異性狀是葉色失綠變淡[7]。目前，已有對甜葉菊[8]、三七[9]和冬小麥[10]等的輻射處理后的葉片細胞的超微結構觀察的報道，但尚無蘭屬植物輻射處理后的植株細胞超微結構的相關研究。本研究以本課題組經(jīng)輻射誘發(fā)的葉藝蘭與未經(jīng)誘變的全綠植株為試材，通過對植物細胞電鏡觀察，以期從細胞超微結構方面闡述植株的差異性，為葉藝蘭品種選育和輻射誘發(fā)葉藝蘭機理研究奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為TRIR-1和TRIR-2植株的組培苗（圖1）。將黃色素花虎頭蘭（Cymbidium tracyanum）與黃蟬蘭（Cymbidium iridioides D. Don）雜交，獲得F1雜交苗，之后通過外觀形態(tài)篩選出性狀穩(wěn)定、一致的F1代株系（TRIR-1），在云南華源輻射有限公司進行60Coγ射線劑量23.6 Gy，劑量率為1 Gy/min，急性照射后，培育2 a，發(fā)現(xiàn)數(shù)株葉藝株系，再經(jīng)過6 a的組培培養(yǎng)，繼代10次后，獲得觀賞價值較高、葉形較為優(yōu)美、個性狀穩(wěn)定的葉藝蘭新品系，命名為TRIR-2。

1.2 方法

取未經(jīng)輻射處理正常的葉片（TRIR-1），葉藝植株葉片的綠色區(qū)（TRIR-2′）與白色區(qū)（TRIR-2″），切成0.5 mm×5 mm 的片段，在戊二醛4℃條件下固定4 h，用618環(huán)氧樹脂包埋[11]，在Leica-R 超薄切片機中切片，切片厚度為50 nm，經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15 min[12]。于日本JEOL 公司的JEM-1011 型透射電鏡，加速電壓100 kv左右，觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 全綠植株葉片葉肉細胞（TRIR-1）的超微結構

TRIR-1的葉肉細胞中細胞質豐富、葉綠體數(shù)量較多且呈梭形（圖2-A），葉綠體結構復雜，外被膜完整，內部片層系統(tǒng)排列有序（圖2-C）；線粒體形狀為橢圓顆粒狀，體積比葉綠體小，線粒體嵴較豐富，線粒體多位于兩個相鄰葉綠體之間（圖2-B）。葉綠體上含有較少的嗜鋨顆粒。

2.2 葉藝葉片綠色部位葉肉細胞（TRIR-2′）的超微結構

TRIR-2′的葉肉細胞壁光滑（圖3-A）、葉綠體呈梭形（圖3-B、3-C），葉綠體數(shù)量較少，葉綠體結構較簡單，外被膜完整，內部片層系統(tǒng)排列較差，分層現(xiàn)象不明顯（圖3-C）；線粒體有溶解現(xiàn)象（圖3-B）。葉綠體上含有較多嗜鋨顆粒。

2.3 葉藝葉片白色部位葉肉細胞（TRIR-2″）的超微結構

TRIR-2″的葉肉細胞中沒有正常的成熟葉綠體，只有發(fā)育初期的原質體，有的原質體被膜完好，多變形膨大，基粒疊垛程度低，基本看不出內部片層系統(tǒng)（圖4-B）；有的原質體外被膜局部破裂，基質外流，內部只見殘存的膜結構（圖4-C），有些葉肉細胞中有線粒體（圖4-C），有些葉肉細胞內沒有發(fā)現(xiàn)任何細胞器，只有細胞壁和極少量的細胞質（圖4-A）。

TRIR-2′葉肉細胞與TRIR-1葉肉細胞的超微結構內含細胞器的類型基本一致，TRIR-2′葉肉細胞與TRIR-1葉肉細胞中，葉綠體均呈梭形，TRIR-2′葉肉細胞的線粒體多位于兩個葉綠體之間，從圖上看來每兩個葉綠體之間線粒體的數(shù)量相差不大，但葉綠體有一定差別，TRIR-2′葉肉細胞的葉綠體數(shù)量明顯少于TRIR-1，TRIR-2′葉肉細胞的葉綠體分層現(xiàn)象比TRIR-1葉肉細胞的葉綠體差，且TRIR-2′葉肉細胞的葉綠體上的嗜鋨顆粒比TRIR-1葉肉細胞的葉綠體多；TRIR-1葉肉細胞與TRIR-2″葉肉細胞的線粒體外膜均較完整，但TRIR-2″葉肉細胞中線粒體多分布在細胞質中，且數(shù)量少于TRIR-1葉肉細胞的線粒體，TRIR-2″葉肉細胞中沒有成熟完整的葉綠體，只有發(fā)育初期的原質體，有的TRIR-2″葉肉細胞甚至未發(fā)現(xiàn)細胞器；TRIR-2′葉肉細胞的線粒體外膜破裂，線粒體溶解，TRIR-2″葉肉細胞的線粒體外膜完整，TRIR-2″葉肉細胞中原質體上沒有發(fā)現(xiàn)嗜鋨顆粒，TRIR-2′葉肉細胞的葉綠體上有較多嗜鋨顆粒。

3 結論與討論

葉綠體和線粒體在植物細胞能量代謝上極具重要性。線粒體是有氧呼吸和形成ATP的主要場所，葉綠體是光合作用的場所[13]。輻射誘變的細胞學效應主要表現(xiàn)在植物細胞和染色體結構方面的變異[14]。羅茂春等用碳離子注入甜葉菊種子后出現(xiàn)萌發(fā)遲緩、生長速度變慢、葉綠體發(fā)育減慢和葉綠體膜被破壞等現(xiàn)象[8]。有研究表明，由于葉綠體內膜系統(tǒng)被破壞，類胡蘿卜素呈現(xiàn)出來，嗜鋨顆粒也大量產生[15]。有研究發(fā)現(xiàn)在未受輻照情況下，三七葉片細胞形態(tài)規(guī)則，細胞內葉綠體數(shù)量多，基粒片層、基質片層多且有序，光合作用能力強，線粒體形態(tài)飽滿，雙層膜完整，管狀內嵴清晰可見，基質濃厚；輻照后，線粒體數(shù)目明顯減少[9]。有研究證實，經(jīng)輻照的葉片細胞細胞內容物減少，一些細胞的細胞器消失，受輻照的葉片細胞中葉綠體比正常的小且數(shù)目減少，發(fā)育異常，葉綠體結構發(fā)生變化，由典型的凸透鏡狀轉變?yōu)殚L形、圓形、亞鈴形或不規(guī)則形[10]。本研究結果也表明，未輻射植物葉片細胞形態(tài)規(guī)則，細胞內葉綠體數(shù)量多，線粒體形態(tài)飽滿，雙層膜完整，基質濃厚；而輻射誘發(fā)的突變體葉藝蘭植株葉片的綠色區(qū)的細胞中的葉綠體數(shù)量減少、腫脹變形，片層結構模糊，部分線粒體外膜破裂、溶解，嗜鋨顆粒增多，而白色區(qū)細胞中無成熟葉綠體，有少量外膜完整的線粒體。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，輻射誘發(fā)的突變體葉藝蘭葉片白色區(qū)細胞中的少量外膜完整的線粒體分布于原質體細胞質中，并非介于兩個相鄰葉綠體之間。相關研究表明，細胞中植物的線粒體在能量轉換中起著其他細胞結構無法取代的作用[16]。因此，本研究推測輻射誘發(fā)的突變體葉藝蘭植株光合作用的產生和能力轉換主要來源于葉片的綠色區(qū)。

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