7種小球藻氨基酸組成及多元性分析

魏文志，付立霞，陳國宏*

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

7種小球藻氨基酸組成及多元性分析

魏文志，付立霞，陳國宏*

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

測定7種小球藻(普通小球藻(C.vul)、自養(yǎng)小球藻(C.aut)、海水小球藻(C.spp.)、微小小球藻(C.min)、蛋白核小球藻(C.pyr)、原始小球藻(C.pro)、橢圓核小球藻(C.ell))氨基酸的組成，對其營養(yǎng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并利用多元分析法對7種小球藻的氨基酸含量差異進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示：7種小球藻氨基酸種類齊全，必需氨基酸占氨基酸總量的比例分別達(dá)到35.86%、39.75%、37.58%、36.35%、38.05%、37.98%、40.28%。必需氨基酸指數(shù)分別為66.63、79.41、67.96、71.17、57.69、70.02、65.39。聚類分析與主成分分析表明4種海水藻氨基酸含量可以聚為一類，3種淡水藻氨基酸含量可以聚為一類，主成分分析構(gòu)建了3個(gè)主成分，其貢獻(xiàn)率：主成分1為73.727%，主成分2為10.021%，主成分3為7.052%，累積貢獻(xiàn)率為90.80%。

小球藻；氨基酸；多元分析

小球藻(Chlorella)為綠藻門(Chlorophyta)的一類普生性單細(xì)胞藻。小球藻能利用光能自養(yǎng)，適應(yīng)于不同的生長環(huán)境，因此易于培養(yǎng)，可快速繁殖和生長，是地球上動(dòng)植物中唯一能在20h增長4倍的生物[1]。同時(shí)小球藻營養(yǎng)豐富，具有抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗病毒、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、降血壓和降血脂等多種作用[2]，因此受到廣泛的關(guān)注，它與螺旋藻、鹽藻、柵藻等微藻的開發(fā)利用一起構(gòu)成了微藻生物技術(shù)(microalgae biotechology)，具有廣闊的發(fā)展前景[3]。

目前國內(nèi)外對小球藻的研究主要包括培養(yǎng)條件、生理作用、分子生物學(xué)、應(yīng)用等幾個(gè)方面[4]，而對不同種小球藻氨基酸差異性分析的研究尚未見報(bào)道。氨基酸是構(gòu)成機(jī)體蛋白質(zhì)的基本單位，食物中的氨基酸含量是決定蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的重要因素。本實(shí)驗(yàn)對7種小球藻氨基酸組成和含量進(jìn)行比較分析，同時(shí)以聚類分析和主成分分析兩種多元分析方法，對7種小球藻的氨基酸含量進(jìn)行綜合分析，旨在為小球藻的營養(yǎng)評(píng)價(jià)、親緣關(guān)系和分類提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

7種小球藻的名稱和來源見表1。

表1 小球藻的名稱、來源Table 1 Names and providers of 7 types of Chlorella

1.2 儀器與設(shè)備

FD-5型真空冷凍干燥機(jī) 上海離心機(jī)械研究所；HP1100型氨基酸分析儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 小球藻的培養(yǎng)

4 種海水小球藻(C.vul、C.aut、C.spp.、C.min)采用f/2培養(yǎng)基[5]，淡水藻(C.pyr、C.pro)采用水生4號(hào)培養(yǎng)基[6]，淡水藻(C.ell)采用MAV培養(yǎng)基[7]。培養(yǎng)在光生物反應(yīng)器中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為26℃，光照度為3000lx，光暗周期為13L:11D(光照13h，黑暗11h)。達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)取樣，離心機(jī)離心得新鮮藻泥，蒸餾水沖洗3次，冷凍干燥，得藻粉。

1.3.2 粗蛋白的測定

采用凱氏定氮法[8]測定，蛋白質(zhì)含量以干質(zhì)量計(jì)。

1.3.3 氨基酸含量的測定

稱取蛋白質(zhì)樣品置于水解管中，加入 6mol/L 的HC1溶液，真空封口，在110℃水解24h，冷卻后定容、過濾、蒸干，再加入 0.02mol/L的HC1溶液在空氣中放置30min，氨基酸分析儀測定17種氨基酸的含量。用質(zhì)量濃度10g/100mL的氫氧化鉀水解，測定色氨酸含量。氨基酸含量以干質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

小球藻營養(yǎng)價(jià)值采用必需氨基酸指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)[9]。

式中：A、B、C…I為小球藻必需氨基酸含量/%；AE、BE、CE…IE為全雞蛋蛋白質(zhì)的必需氨基酸含量/%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對7個(gè)種的小球藻進(jìn)行聚類分析、主成分分析，研究種間氨基酸差異。

1.4.1 聚類分析

根據(jù)所得7個(gè)種小球藻氨基酸的種類和含量，構(gòu)建SPSS數(shù)據(jù)文件。采用的聚類方法為歐式距離(euclidean distance)的最短系統(tǒng)聚類法(nearest neighbor)進(jìn)行樣品聚類，用樹形圖顯示種間的親疏程度[10]。

1.4.2 主成分分析

通過軟件分析，從所有氨基酸指標(biāo)中得出3個(gè)綜合性指標(biāo)，即3個(gè)主成分，計(jì)算機(jī)軟件分析輸出主成分1、主成分2、主成分3的貢獻(xiàn)率和三者的累積貢獻(xiàn)率，顯示各主成分的負(fù)荷因子即貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種小球藻藻粉的蛋白質(zhì)含量

表2 7種小球藻的蛋白質(zhì)含量Table 2 Contents of proteins in 7 types of Chlorella (g/100 g dry weight)

從表2可以看出，7種小球藻蛋白質(zhì)含量有明顯的差別，最低的C.vul為30.58g/100g，最高的C.pyr為53.79g/100g。4種海水種類的小球藻蛋白質(zhì)含量低于淡水種類。

2.2 氨基酸組成

表3 不同種小球藻氨基酸組成及含量Table 3 Amino acid composition of 7 types of Chlorella

由表3可知，7種小球藻均含有18種氨基酸，包括人體所需的8種必需氨基酸，各種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低順序基本相似，都是以亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、甘氨酸等較高，而甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸含量較低。必需氨基酸的含量較高，占氨基酸總量的比例分別達(dá)到35.86%、39.75%、37.58%、36.35%、38.05%、37.98%、40.28%，均接近世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)提出的TEAA/TAA約為40%[11]。

2.3 必需氨基酸指數(shù)評(píng)價(jià)

通過計(jì)算小球藻必需氨基酸占粗蛋白質(zhì)的含量，與全雞蛋蛋白質(zhì)的必需氨基酸的含量進(jìn)行比較，得出7種小球藻必需氨基酸指數(shù)，見表4。

表4 7種小球藻必需氨基酸組成評(píng)價(jià)Table 4 Evaluation of EAA composition of 7 types of Chlorella (mg/g crude protein)

由表4可以看出，7種小球藻蛋白質(zhì)的必需氨基酸指數(shù)有差異，最高的C.aut為79.41，依次為C.min、C.pro、C.spp.、C.vul、C.ell，最低的 C.pyr為 57.69。

2.4 聚類分析

通過對7種小球藻氨基酸含量進(jìn)行聚類分析，得到氨基酸含量聚類圖(圖1)。結(jié)果表明，總體上4種海水藻可以聚為一類，3種淡水藻可以聚為一類。說明海水藻和淡水藻中的氨基酸含量存在差異。海水藻中，C.vul和 C.min氨基酸含量最為接近，然后依次為C.aut和C.spp.。淡水藻中，C.pyr與C.pro氨基酸含量接近，然后是 C.ell。

圖1 7種小球藻聚類分析樹形圖Fig.1 Hierarchical cluster analysis dendrogram for 7 types of Chlorella

2.5 主成分分析

表5 主成分負(fù)荷因子及其貢獻(xiàn)率Table 5 Loading factors and contribution rates of three principal components from 7 types of Chlorella

由表5可知，總方差的貢獻(xiàn)率分別為：主成分1為73.727%，主成分2為10.021%，主成分3 為7.052%，累積貢獻(xiàn)率為90.80%。3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率高，說明用幾個(gè)相互獨(dú)立的因子可以概括不同種間的差異。結(jié)合圖2，可以更直觀的看出，主成分1包括Leu、Thr、Asp、Ser、Val、Gly、Lys、Tyr、His、Ala、Ile等負(fù)荷因子，主成分2包括Trp、Met等負(fù)荷因子，主成分3包括Cys等負(fù)荷因子。

圖2 主成分因子負(fù)荷散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter diagram for the loading factors of principal components

3 討 論

小球藻具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功效，蛋白質(zhì)含量高是其中的原因之一。本實(shí)驗(yàn)中各種小球藻蛋白質(zhì)含量差異較大，特別是4種海水藻類低于3種淡水藻類。已有報(bào)道[12]，我國常見的種類有蛋白核小球藻(C. pyr)、橢圓小球藻(C.ell)和普通小球藻(C.vul)，其中蛋白核小球藻中的蛋白質(zhì)含量最高。本實(shí)驗(yàn)中，蛋白核小球藻(C.pyr)的蛋白質(zhì)含量也是最高的。除了不同種小球藻本身的蛋白質(zhì)代謝差異外，培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽成分對小球藻蛋白質(zhì)的含量有影響[13]，特別是培養(yǎng)液中氮源對微藻蛋白質(zhì)的質(zhì)和量有直接的影響[14]，本實(shí)驗(yàn)中不同的配方培養(yǎng)不同種的小球藻，可能也是不同種類小球藻蛋白質(zhì)含量差異的原因。

蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值體現(xiàn)在氨基酸組成與含量，特別是必需氨基酸的組成與含量，7種小球藻含有8種人體必需氨基酸，而且必需氨基酸的含量較高，占氨基酸總量的比例均接近世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)提出的TEAA/TAA約為40%，說明7種小球藻的營養(yǎng)價(jià)值較高。

必需氨基酸指數(shù)(EAAI)用于評(píng)價(jià)食物蛋白質(zhì)的質(zhì)量，EAAI越接近100，食物蛋白與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的必需氨基酸組成越接近，營養(yǎng)價(jià)值越高[15]。7種氨基酸中，營養(yǎng)價(jià)值相對較高的為C.aut、C.min和C.pro。

聚類分析可將不同種群進(jìn)行初步歸類，量化種群間的差異程度，分析種群間的相似程度。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示4種海水藻可聚為一類，3種淡水藻可聚為一類，與它們蛋白質(zhì)含量上的差異相類似。海水藻和淡水藻在氨基酸含量上的差異首先應(yīng)該是二者自身遺傳物質(zhì)的差異決定的，同時(shí)朱松玲等[16]也報(bào)道，鹽度對微藻氨基酸含量有直接的影響。小球藻為單細(xì)胞生物，直接與水體進(jìn)行物質(zhì)代謝和能量交換，海水藻為在海水的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有較多的氯化鈉等離子成分，可能影響了小球藻的物質(zhì)代謝，從而影響了氨基酸含量。

主成分分析是將多個(gè)氨基酸含量綜合成少數(shù)幾個(gè)因子，從而得出不同種類的差異大小，并可根據(jù)不同種類的主成分值找出各種類在各主成分值上差異較大的參數(shù)。小球藻氨基酸主成分分析結(jié)果顯示7種小球藻氨基酸差異的3個(gè)累計(jì)貢獻(xiàn)率為90.80%。根據(jù)主成分分析所得的各個(gè)負(fù)荷因子的相應(yīng)貢獻(xiàn)率所作的散點(diǎn)圖顯示，Leu、Thr、Asp、Ser、Val、Gly、Lys、Tyr、His、Ala、Ile 等負(fù)荷因子對各種類小球藻氨基酸差異分析影響較大，可以作為類似研究的分析指標(biāo)，主成分分析方法使不同種類小球藻氨基酸差異分析更為簡單。但不同種類小球藻氨基酸含量差異的原因，有待于進(jìn)一步深入研究。

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Multivariate Analysis of Amino Acid Composition of 7 Types of Chlorella

WEI Wen-zhi，F(xiàn)U Li-xia，CHEN Guo-hong*(College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

Multivariate analysis was conducted to evaluate the amino acid composition and nutritional values of 7 types of Chlorella including Chlorella vulgaris, Chlorella autotrophica, Chlorella minutissim, Chlorella spp., Chlorella pyrenoidosa,Chlorella protothecoides and Chlorella ellipsoidea. The results showed all kinds of amino acids were detected in the 7 types of Chlorella. The ratios between essential amino acids and total amino acids were 35.86%, 39.75%, 37.58%, 36.35%, 38.05%,37.98% and 40.28%, and the essential amino acid indexes were 66.63, 79.41, 67.96, 71.17, 57.69, 70.02 and 65.39 in Chlorella vulgaris, Chlorella autotrophica, Chlorella minutissim, Chlorella spp., Chlorella pyrenoidosa, Chlorella protothecoides and Chlorella ellipsoidea, respectively. Cluster analysis and principal component analysis indicated that Chlorella cultured in seawater-based medium and freshwater-based medium could be classified as two different types according to the contents of amino acids. Three principal components were analyzed to reveal a contribution rate of 73.727% for the first principal component, 10.021% for the second principal component and 7.052% for the third principal component, respectively. The cumulative contribution rate of three principal components was 90.80%.

Chlorella；amino acid；multivariate analysis

Q517

A

1002-6630(2011)05-0254-04

2010-06-30

魏文志(1970—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯镳D料與生態(tài)。E-mail：wzwei38@sohu.com

*通信作者：陳國宏(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檫z傳資源評(píng)價(jià)與利用。E-mail：ghchen@yzu.edu.cn