諾斯卡品對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制與誘導(dǎo)凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究

摘 要：目的：研究諾斯卡品對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。方法：用不同濃度諾斯卡品作用于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG 24，.48小時，觀察形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特性的改變。結(jié)果：諾斯卡品可以明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡。結(jié)論：諾斯卡品可以嘗試作為膠質(zhì)瘤病人治療的新型化療藥物。

關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤細(xì)胞；凋亡；Caspase；bcl-2

膠質(zhì)瘤（Glioma）是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，傳統(tǒng)治療主要包括腫瘤切除和放射治療。但由于腫瘤侵襲性極強(qiáng)，術(shù)后復(fù)發(fā)率極高。

諾斯卡品多年來一直作為鎮(zhèn)咳藥物使用，近年來抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)諾斯卡品及其衍生物具有抗癌活性，通過作用于微管，使腫瘤細(xì)胞長期處于靜止期，從而影響有絲分裂達(dá)到抑制增殖的目的。

體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明諾斯卡品能夠明顯抑制乳腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖和周圍血管生成，并誘導(dǎo)其凋亡。更為重要的是，在多種小鼠腫瘤模型中，它對心、腎和肝臟等重要臟器無毒性或僅有輕微毒性。目前研究發(fā)現(xiàn)諾斯卡品誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制主要與caspase家族級聯(lián)反應(yīng)、線粒體途徑、以及Bcl-2家族成員相關(guān)。

本研究擬通過諾斯卡品作用于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG，觀察其增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 方法

用諾斯卡品（50，100μmol/L）作用于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG 24，.48小時，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性的改變。利用細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)（MTT方法）觀察不同濃度諾斯卡品對細(xì)胞活性的影響；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞生長周期變化；蛋白免疫印跡法（Western Blotting）檢測經(jīng)諾斯卡品處理后Bcl-2，及Bax，等相關(guān)凋亡因子蛋白表達(dá)水平的變化。

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±S.D.）表示。所有數(shù)據(jù)在SPSS13.0軟件包上處理。采用非獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)， Spearman等級相關(guān)分析。P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)選擇合適的諾斯卡品作用濃度

我們選擇了5個濃度梯度的諾斯卡品（25，50，100，200，

400μmol/L）作用于U87-MG細(xì)胞24h，48h，72h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)諾斯卡品對U87-MG細(xì)胞具有明顯的抑制作用。濃度為50μmol/L的諾斯卡品24，48，72h后抑制率相近，在20%左右。濃度為400μmol/L的諾斯卡品24h.，48h，72h后，細(xì)胞的增殖抑制率相近，在85%左右。濃度為100μmol/L的諾斯卡品24h.，48h，72h后，抑制率在50%左右。

2.2 倒置顯微鏡觀察諾斯卡品對細(xì)胞形態(tài)的影響

用濃度為100μmol/L諾斯卡品作用于U87-MG細(xì)胞48h后，可見到培養(yǎng)基內(nèi)部分細(xì)胞呈不完全貼壁生長狀態(tài)，貼壁的細(xì)胞間連接減少、存在細(xì)胞碎片。對照組的細(xì)胞則貼壁生長，連接緊密，突觸多，核分裂象多見。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化

U87-MG細(xì)胞經(jīng)過諾斯卡品100μmol/L處理24h，48h后，收集所有漂浮和貼壁的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測，諾斯卡品抑制U87-MG細(xì)胞于M期，表明諾斯卡品誘導(dǎo)的增殖抑制作用和細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。

2.4 諾斯卡品通過caspase家族級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)U87-MG細(xì)胞凋亡

Caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中是執(zhí)行凋亡的主要酶類，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，諾斯卡品作用于U87-MG細(xì)胞24，48h后，可檢測到Caspase-3的激活以及PARP的裂解。

眾所周知，抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途中在多種人類腫瘤的形成及發(fā)展中起重要作用。諾斯卡品作用于U87-MG后可以檢測到Bcl-2蛋白的表達(dá)下降，但本實(shí)驗(yàn)未檢測到Bax蛋白的表達(dá)有明顯變化（P<0.05）。

3 討論

諾斯卡品作為圍觀抑制劑可以使微管長時間的處于靜止期，但細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的總量保持不變。這可能是動物模型實(shí)驗(yàn)中諾斯卡品對重要臟器無明顯毒副作用的原因。諾斯卡品對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用可能是由于腫瘤細(xì)胞存在紡錘體作用點(diǎn)機(jī)制的缺陷。

MTT結(jié)果表明諾斯卡品作用后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG生長受到了明顯的抑制，且藥物濃度、作用時間與細(xì)胞活性呈較好的線性關(guān)系。

大量研究表明，caspase家族級聯(lián)反應(yīng)參與了細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制?；罨腃aspase通過特異性裂解底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，分為凋亡起始因子Caspase-2，8，9和凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，6，7（15）。細(xì)胞凋亡開始后，起始因子激活執(zhí)行因子，最終激活Caspase-3，導(dǎo)致PARP蛋白的剪切。諾斯卡品作用于人腦膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)檢測到了Caspase-3的激活和PARP的剪切。

Bcl-2作為重要的抗凋亡基因，在諾斯卡品作用組和對照組中表達(dá)量的明顯差異說明可能是通過控制抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的增殖和存活。使用諾斯卡品作用后Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，而Bax蛋白的表達(dá)基本無變化。說明諾斯卡品是通過通過作用于Bcl-2因子使其蛋白水平得以相應(yīng)降低并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明在體外實(shí)驗(yàn)中諾斯卡品可以明顯抑膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG的增殖并促進(jìn)其凋亡，其過程可能有多條信號通路共同調(diào)控，有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡介：范菁（1984-），女，浙江杭州人，神經(jīng)腫瘤。