梅毒螺旋體Tp0453-Tp0257重組融合蛋白的表達(dá)及作為梅毒診斷候選抗原的初步研究*

郭龍華，彭小麗，伍曉飛，吳文權(quán)，劉夢瓊

(1.深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518109；2.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院田竂社康中心；3.海南省人民醫(yī)院檢驗科)

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梅毒螺旋體Tp0453-Tp0257重組融合蛋白的表達(dá)及作為梅毒診斷候選抗原的初步研究*

郭龍華1，彭小麗1，伍曉飛2，吳文權(quán)1，劉夢瓊3**

(1.深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518109；2.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院田竂社康中心；3.海南省人民醫(yī)院檢驗科)

摘要：目的 本研究旨在探討梅毒螺旋體Tp0453-Tp0257重組融合蛋白檢測梅毒感染的可能性。方法 用基因合成的方法構(gòu)建重組pET-28a-Tp0453-Tp0257質(zhì)粒，重組融合蛋白的鑒定用SDS-PAGE和Western blot分析鑒定，重組融合蛋白作為抗原用于ELISA實(shí)驗，該蛋白的靈敏度用來自一期、二期、三期和隱性梅毒患者的血清(90例)進(jìn)行評估，其特異性用正常體檢者的血清(120例)評估。結(jié)果 Western Blot分析證實(shí)了Tp0453-Tp0257重組融合蛋白能與梅毒陽性血清反應(yīng)。該蛋白對梅毒診斷的總靈敏度為97.8%、總特異性為100.0%。結(jié)論 本實(shí)驗Tp0453-Tp0257重組融合蛋白作為新的梅毒特異診斷的候選抗原，取得較好的實(shí)驗效果，有望進(jìn)入臨床推廣使用。

關(guān)鍵詞：梅毒；Tp0453；Tp0257；重組融合蛋白；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

梅毒(Syphilis)由梅毒密螺旋體蒼白亞種(TP)引起，近幾年國內(nèi)梅毒感染者有明顯的增多趨勢[1]，青霉素治療梅毒有效，但仍然全球流行，部分原因是由于目前檢測方法不夠靈敏和特異[2]。梅毒螺旋體的實(shí)驗室檢測主要包括：病原體、非特異性抗體、特異性抗體及基因的檢測。目前應(yīng)用較多的檢測方法是血清學(xué)抗體檢測。

膜蛋白是TP的主要免疫原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng),多種膜蛋白對TP具有診斷學(xué)意義和免疫保護(hù)作用，這為TP診斷和疫苗候選基因奠定了基礎(chǔ)。近年來，用純化的重組蛋白作ELISA包被抗原，其敏感性和特異性均有所提高[3]。已有不少學(xué)者采用基因工程重組技術(shù)表達(dá)了具有高度免疫原性的TP膜蛋白Tpp47(Tp0574)、Tpp17(Tp0425)、Tpp15(Tp0171)、Tpp44.5(TmpA)中的一種或多種，并用其建立梅毒抗體的血清學(xué)檢測方法，能顯著提高檢測的特異性和敏感性,但也存在一些問題，不同患者不同梅毒感染階段對這些膜蛋白具有不同的抗體譜，因而對梅毒的診斷靈敏度和特異性存在差異[4]。

由于Tp0453蛋白位于TP細(xì)胞外膜，整個分子的抗原性均較強(qiáng)，其編碼產(chǎn)物與其他細(xì)菌無同源性[5]。Smith BC等人的研究顯示重組Tp0453蛋白作為ELISA的診斷抗原其敏感性達(dá)到98%，特異性達(dá)到99%[2]。膜蛋白Tp0257(Gpd)抗原性強(qiáng)，研究顯示以重組Tp0257(Gpd)蛋白抗原檢測早期梅毒、晚期梅毒和神經(jīng)梅毒的敏感性和特異性分別為9l%和93%[6]。Tp0257蛋白基因因其不僅存在于所有TP各亞種基因組中，而且其序列高度保守，抗原性強(qiáng)，而被認(rèn)為是更合適的TP疫苗候選基因。 雖然Tp0453蛋白和Tp0257蛋白有各自的優(yōu)點(diǎn)，但未見Tp0453-Tp0257重組融合蛋白用于診斷梅毒的研究報道。在本研究中，我們構(gòu)建Tp0453-Tp0257重組融合蛋白作為診斷梅毒的抗原，并用不同梅毒感染階段的血清評價該重組蛋白對于梅毒診斷的意義。

1材料與方法

1.1構(gòu)建能表達(dá)Tp0453-Tp0257重組質(zhì)粒pET-28a-Tp0453-Tp0257從GeneBank獲得Tp0453和Tp0257的序列，委托上海吉凱生物科技有限公司合成Tp0453和Tp0257序列，它們之間用(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)3 [(GGGGS)3]連接，然后以pET-28a為質(zhì)粒載體制備重組質(zhì)粒pET-28a-Tp0453-Tp0257，并用DNA測序證實(shí)構(gòu)建的質(zhì)粒是正確的。

1.2Tp0453-Tp0257重組融合蛋白的表達(dá)和純化將測序正確的pET-28a-Tp0453-Tp0257質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中(康為世紀(jì)貨號：CW0810A)涂板過夜培養(yǎng)。挑選若干外形飽滿的單克隆菌落于5ml LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，后以1∶100比例接入10ml培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)3h，加入終濃度為0.8mM的IPTG，30℃培養(yǎng)5h，收樣。收集菌液，加loading buffer裂解，上樣。SDS-PAGE分離膠濃度：10%，上樣量10μl。如果挑選能夠表達(dá)重組Tp0453-Tp0257的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后，超聲破碎細(xì)菌，離心，用上樣緩沖液(20 mM Tris (pH 7.5)，500 mM NaCl，20 mM咪唑)重懸，按照Ni2+-His-Resin試劑盒(南京金斯瑞生物科技有限公司)純化蛋白的方法純化重組Tp0453-Tp0257，用Western Blot方法鑒定。

1.3Western Blot分析不同樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，以梅毒陽性血清為一抗( 1∶1000)， 以羊抗人IgG( 1∶3000)作為二抗進(jìn)行 Western blot 檢測，拍照記錄結(jié)果。

1.4ELISA方法的建立建立間接測定法，用96孔酶標(biāo)板包被抗原/包被液(pH8.6 0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液)，4℃過夜后，用洗滌液(pH7.40,0.02mol/L PBS-0.05% Tween 20)洗滌，然后4℃冰箱保存。將測定血清在反應(yīng)板孔中用稀釋液(pH7.40,0.02mol/L PBS-0.05% Tween 20 含5%小牛血清)1∶10稀釋混勻后，放置37℃孵育30min,洗滌三次吸干后，每孔加酶標(biāo)記物100μl，放置37℃孵育30min， 取出洗滌五次吸干后，加入鄰苯二胺溶液顯色。37℃暗室10min，用1mol/L硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀450nm測定各孔A值。

1.5抗原濃度的選擇分別用5，10，20和25μg /ml抗原濃度包被，用梅毒抗體陽性對照血清測定，其測定結(jié)果的數(shù)據(jù)無明顯差異，本文選用了5μg /ml作為包被濃度。

1.6血清標(biāo)本的收集及檢測正常人健康體檢人員120名，一期梅毒 40例、二期梅毒15例、三期梅毒20例、隱性梅毒15例。所檢測的血清均用甲苯胺紅不加熱血清試驗(TRUST)過篩和梅毒微粒凝集試驗(TPPA)確認(rèn)。陰、陽性質(zhì)控對照血清分別用Blot-Vision TP-45(Western Blot)和TPPA方法進(jìn)行確認(rèn)。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pET-28a-Tp0453-Tp0257的鑒定重組質(zhì)粒pET-28a-Tp0453-Tp0257的鑒定是用DNA測序進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2SDS-PAGE分析Tp0453-Tp0257重組融合蛋白在原核生物中的表達(dá)收集處于對數(shù)期轉(zhuǎn)化到BL21的細(xì)菌(OD=0.6)，用上樣裂解液處理細(xì)菌后離心，去上清液10μl，用SDS-PAGE分析。結(jié)果見圖1(封三)，從圖1可以看出有一條分子量為70kD的蛋白表達(dá)，與所預(yù)測的分子量一致。

2.3Western Blot鑒定Tp0453-Tp0257重組融合蛋白的表達(dá)Western blot 檢測顯示，Tp0453-Tp0257重組融合蛋白與梅毒患者血清反應(yīng)，與梅毒陰性患者血清均不發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn)良好的梅毒血清學(xué)反應(yīng)活性，見圖2(封三)。

2.4ELISA方法的建立和臨床標(biāo)本的檢測由于以5、10、20和25μg /ml作為包被濃度能與衛(wèi)計委檢驗中心得到的梅毒血清均有陽性反應(yīng)，且檢測結(jié)果無限制性差異，我們選擇以5μg /ml作為包被濃度。然后我們對從臨床收集的梅毒陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本進(jìn)行檢測，實(shí)驗結(jié)果表明該蛋白對梅毒診斷的總靈敏度為97.8%(88/90)、總特異性為100.0%(120/120)。見表1。

表1　Tp0453-Tp0257重組融合蛋白包被的ELISA對臨床標(biāo)本的檢測[n(%)]

3討論

目前用于梅毒血清學(xué)診斷的許多重組抗原是脂蛋白，如Tpp44.5，Tpp15,Tpp17和Tpp47。脂蛋白抗原通過TLR2(Toll-like receptors2)激活抗原呈遞細(xì)胞，刺激強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[7]。這些TP外膜蛋白已聯(lián)合應(yīng)用于 ELISA梅毒檢測試劑盒中，但仍有假陽性和早期梅毒假陰性結(jié)果[8]。 Tp0453 抗原可能是最具潛力的梅毒血清學(xué)診斷候選外膜抗原之一，與其它已知的外膜整合蛋白結(jié)構(gòu)不同， Tp0453 無片層結(jié)構(gòu)，不能穿過外膜形成表面暴露，而是深入胞質(zhì)中，與其他細(xì)菌無同源性，與螺旋體其他菌屬也無交叉反應(yīng)。計算機(jī)分析預(yù)測Tp0257(Gpd)是一個脂蛋白，用14C標(biāo)記棕櫚酸研究證實(shí)了該蛋白是脂修飾的[9]。雖然脂蛋白Gpd較非脂蛋白Tp0155，Tp0483和 Tp0751顯示更高的靈敏度，但仍有早期梅毒患者的血清不能和Gpd反應(yīng)。

在本研究中，我們采用全基因組合成的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-Tp0453-Tp0257，在Tp0453和Tp0257之間用(GGGGS)3]連接以保證它們各自的柔性。重組質(zhì)粒pET-28a-Tp0453-Tp0257轉(zhuǎn)化BL21后在IPTG誘導(dǎo)下能夠產(chǎn)生可溶的重組融合蛋白Tp0453-Tp0257，SDS-PAGE和Western Blot分析證明Tp0453-Tp0257重組融合蛋白陽性梅毒血清反應(yīng)。然后以Tp0453-Tp0257重組融合蛋白作為包被抗原制備的ELISA試劑盒對來自梅毒陰性和梅毒感染不同階段的血清樣本進(jìn)行檢測，以評估重組融合蛋白對梅毒的診斷意義。我們的結(jié)果表明Tp0453-Tp0257重組融合蛋白對梅毒的總特異性為100%，對一期梅毒的靈敏度為95.0%，對二期、三期和隱性梅毒的靈敏度均為100.0%，對梅毒診斷的總靈敏度為97.8%。國內(nèi)有多位學(xué)者探討Tp0453作為診斷梅毒的抗原。王憲靈[8]曾對 Tp0453 抗原優(yōu)勢表位區(qū)段( 62aa- 224aa) 進(jìn)行構(gòu)建表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物與梅毒患者血清具有良好的 ELISA 反應(yīng)性。張薇[10]也發(fā)現(xiàn)一期梅毒中 Tp0453 檢出率高于其它各期梅毒。Smith等[2]也證明Tp0453對各期梅毒診斷的靈敏度和特異性分別為98%和99%，但發(fā)現(xiàn)被Tp0326、Tp0453和融合蛋白鑒定的三份假陰性標(biāo)本，TPPA鑒定為陽性。這表明以Tp0453為核心蛋白診斷梅毒也有漏檢的可能。我們對來自臨床的標(biāo)本分析表明該重組融合蛋白對梅毒診斷的靈敏度和特異性超過或至少等同目前國內(nèi)梅毒診斷的商業(yè)試劑盒。但我們的研究存在一些缺陷，一是樣本量不夠大，如果將來用Tp0453-Tp0257重組融合蛋白作為梅毒診斷的抗原，需要大樣本進(jìn)行研究；二是沒有比較Tp0453-Tp0257重組融合蛋白和Tp0453蛋白作為梅毒診斷抗原對梅毒診斷的差異。這些是下一步研究的重點(diǎn)。

總之，我們表達(dá)純化了Tp0453-Tp0257重組融合蛋白，對該蛋白用于梅毒的診斷具有很高的特異性和靈敏度，有作為多種梅毒診斷試劑盒用抗原的潛能。

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(收稿日期：2016-01-07)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.02.0140

中圖分類號：R377.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：2095-4646(2016)02-0140-03

基金項目：深圳市龍華新區(qū)科技創(chuàng)新資金“社會公益科研項目”(2013039)；海南省自然科學(xué)基金資助項目(811177)。

**通信作者，E-mail:mq69693@126.com