低分子柑桔果膠粉對哮喘小鼠Th1/Th2平衡及核因子NF-κB表達的影響*

黃　娟，劉秀芬，2，余紅蕾，王立瓊，程首超，程學文，趙紅玲**

(1.咸寧市中心醫(yī)院兒內科，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院)

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低分子柑桔果膠粉對哮喘小鼠Th1/Th2平衡及核因子NF-κB表達的影響*

黃娟1，劉秀芬1，2，余紅蕾1，王立瓊1，程首超1，程學文1，趙紅玲1**

(1.咸寧市中心醫(yī)院兒內科，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院)

摘要：目的 探討核因子-κB(NF-κB)和Th1/Th2免疫失衡在哮喘小鼠模型中的作用及低分子柑桔果膠粉防治的機制。方法 用卵清白蛋白(OVA)建立哮喘模型。BALB/c小鼠隨機分為四組：正常對照組、哮喘組、低分子柑桔果膠治療組、地塞米松治療組，每組10只。留取支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行細胞總數計數和分類計數；應用ELISA法檢測BALF中IL-4、IFN-γ濃度，采用免疫組化檢測NF-κB的表達。結果 低分子柑桔果膠粉治療組血和BALF中IL-4的含量明顯低于哮喘組(P<0.05)； 低分子柑桔果膠粉治療組哮喘小鼠肺組織中NF-κB陽性細胞百分比顯著低于哮喘組(P<0.05)； 哮喘小鼠肺組織中NF-κB表達與BLAF中的IL-4濃度成顯著正相關(P<0.05)，而與BLAF中的IFN-γ濃度成顯著負相關(P<0.01)。結論 低分子柑桔果膠粉能降低支氣管哮喘小鼠血清及BALF中炎癥因子IL-4的濃度，減輕支氣管哮喘模型小鼠肺組織病理損害,可能的機制是調節(jié)Th1/Th2平衡及抑制NF-κB激活,減少氣道上皮的NF-κB表達,從而阻止哮喘的發(fā)生發(fā)展。

關鍵詞：低分子柑桔果膠粉(MCP)；哮喘；NF-κB；IL-4；IFN-γ；Th1/Th2平衡

低分子柑桔果膠(MCP)是從天然產物柑桔中經過特殊技術提取得到的一種以半乳糖為主要成份的多糖。動物實驗證實，MCP有直接增強免疫功能的作用，可糾正炎癥中Th1/Th2 失衡，調節(jié)CD4+/ CD8+細胞的比例，增強單核細胞細胞毒作用及巨噬細胞的吞噬功能[1]。國外已經廣泛用于腫瘤的研究和治療[2]，但國內外尚無其用于哮喘治療的研究報道。本文將探討MCP粉對哮喘小鼠Th1/Th2失衡及核轉錄因子NF-κB的調節(jié)作用。

1材料與方法

1.1小鼠哮喘模型的建立及劑量設計SPF級BALB/c雄性小鼠40只(由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供)，體重14～18g，隨機分為正常對照組(A組)，哮喘組(B組)，低分子柑桔果膠治療組(C組)，地塞米松治療組(D組),每組10只。采用V級OVA制備模型，哮喘模型的制作參照文獻[3]的方法略作改進，分致敏、激發(fā)兩個階段，方法如下：于第8d和第21d腹腔注射0.1ml含1%OVA的Al(OH)3凝膠致敏，各一次，共2次，第32d開始使用空氣壓縮霧化器向置于密閉有機玻璃容器內的小鼠噴霧1%OVA，每天吸入30min，連續(xù)定時激發(fā)1周。C組于激發(fā)前每天8:30按2400mg/kg灌胃低分子柑桔果膠。D組于每次激發(fā)前1h按0.5mg/kg腹腔注射地塞米松液。A組以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。根據實驗用品說明，成人服用MCP粉的劑量為80mg/(kg·d)，因動物實驗的最高劑量為人類劑量的30倍，所以設計MCP劑量為2400mg/(kg·d)。

1.2實驗方法各組末次激發(fā)24h內處死，眼球動脈取血，收集血清，肺組織進行支氣管肺泡灌洗并留取支氣管肺泡灌洗液(BALF)經2000rpm離心15min，取上清液檢測IFN-γ和IL-4濃度。支氣管肺泡灌洗小鼠收取BALF，細胞分類計數使用瑞士染色。BALF沉渣用1mlPBS液重懸，取200μl滴于玻片上自然晾干備用，余用槍頭抽取100μl至細胞計數板，用低倍鏡計數四角的四大方格中白細胞總數。按下式計算小鼠細胞總數：白細胞數/L=(四大方格內白細胞總數*107)/4。BALF沉渣涂片待自然晾干后，加瑞氏液2～4滴，固定0.5～1min，再加等量緩沖液與染料混勻，染色5～10min，用自來水沖去染液。選擇涂片體尾交界處染色良好區(qū)域，在高倍鏡下，按一定順序移動視野，根據形態(tài)特征對200個白細胞，按嗜酸性粒細胞(EOS)、淋巴細胞(Lym)、巨噬細胞(Mφ)、以及中性粒細胞(Neu)作細胞分類計數，所有計數均由一個研究者完成，采用單盲法。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定BALF中IFN-γ、IL-4濃度，免疫組化SP法測肺組織中NF-κB活化值，測定方法按試劑說明書進行操作。

2結果

2.1HE染色觀察B組小鼠肺組織切片HE染色可見肺內支氣管粘膜下、肺內支氣管及血管周圍較多炎性細胞浸潤，以EOS、Lym、Neu為主，粘膜下水腫，粘液腺增生，氣道上皮多處斷裂和上皮細胞的脫落，肺間質和支氣管腔內可見炎性細胞滲出和分泌物，支氣管壁略顯增厚和基底膜輕度增厚且不規(guī)則，細支氣管平滑肌輕度肥大。C組和D組小鼠肺組織炎性細胞浸潤等病理改變較B組明顯減輕。見圖1(封二)。

2.2PAS染色觀察A組小鼠肺組織切片PAS染色未見黏液分泌；B組PAS染色可見氣道上皮杯狀細胞增生肥大，大量黏液形成黏液栓；C組和D組肺組織PAS染色與B組相比杯狀細胞增生不明顯，黏液分泌明顯減少。見圖2(封二)。

2.3電鏡觀察A組小鼠顯示正常肺泡Ⅱ型上皮細胞，支氣管纖毛上皮細胞纖毛排列齊整，肺泡隔結構正常，表面微絨毛豐富；未見淋巴細胞及嗜酸性粒細胞附壁及浸潤；肺細小動脈內膜、中膜、外膜清晰，內皮細胞扁平，平滑肌細胞之間有散在的膠原纖維，見圖3(A)。B組小鼠電鏡觀察顯示肺間質有EOS浸潤，肺泡Ⅱ型上皮細胞水腫，核輕度固縮，胞漿部分內質網擴張，表面微絨毛部分脫落，線粒體輕度腫脹。支氣管纖毛上皮細胞纖毛排列稀疏，有斷裂、融合現象；肺泡腔及血管壁有多個巨噬細胞浸潤,見圖3(B)。C組程度較B組有所減輕，D組可見肺泡Ⅱ型細胞結構接近正常，炎癥細胞明顯減少，見圖3(C、D)。

圖3　小鼠肺組織電鏡圖(×10000)

A組正常肺泡隔結構。B組顯示內皮細胞受損，線粒體空泡形成(黑色箭頭所示)。C組和D組細胞結構較B組完整，炎癥細胞減少

2.4各組小鼠BALF中細胞計數與分類計數的比較結果顯示B組BALF中細胞總數、EOS百分比均顯著高于A組(P<0.01)，C組BALF中細胞總數、EOS百分比低于B組(P<0.01或P<0.05)，但仍顯著高于A組(P<0.01)。見表1。

表1　各組小鼠BALF中細胞總數和分類計數±s)

與A組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.05、##P<0.01

注：實驗中因技術原因標本不合格，故小鼠數量與原來每組數量不同(下同)

2.5各組小鼠BALF中IL-4和IFN-γ濃度的變化根據系列稀釋500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.6pg/ml、7.8pg/ml、0pg/ml的標準品獲得的OD值，繪制濃度一光密度標準曲線，以此標準曲線為標準，將待測標本在自動酶標儀測得的OD值轉換成IL-4濃度值和IFN-γ濃度值。BALF中IL-4濃度B組明顯高于A組、D組(P<0.01)。IFN-γ濃度B組顯著低于A組(P<0.01)，C組比B組高，但無顯著差別(P>0.05)。見表2。

表2　各組小鼠血清、BALF中IL-4濃度的變化

與A組比較，*P<0.05、**P<0.01；與B組比較，#P<0.05、##P<0.01

2.6各組小鼠血清中IL-4濃度變化和肺組織NF-κB活化的比較根據系列稀釋500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.6pg/ml、7.8pg/ml、0pg/ml的標準品獲得的OD值，繪制濃度一光密度標準曲線，以此標準曲線為標準，將待測血清在自動酶標儀測得的OD值轉換成IL-4濃度值。血清中IL-4濃度B組高于A組(P<0.01)，C組血清中IL-4濃度明顯比B組低(P<0.01)。但是D組與B組比較差異無顯著性(P>0.05)。NF-κB主要表達于支氣管上皮細胞胞漿及核內，支氣管上皮細胞胞核、間質炎性細胞核可見棕黃色顆粒，為NF-κB免疫陽性蛋白，以核陽性染色的細胞比例作為NF-κB的活化值。B組NF-κB核陽性染色細胞最多，明顯多于A組(P<0.01)其余三組呈不同程度的升高，介于A組和B組之間(P<0.05或P<0.01)。相關性分析顯示小鼠肺組織中NF-κB的表達與血清中IL-4濃度(r=0.806,P<0.01)成正相關。見表3。

表3　各組小鼠血清中IL-4濃度變化及肺組織NF-κB活化的比較±s)

與A組比較，*P<0.05、**P<0.01；與B組比較，#P<0.05、##P<0.01

3討論

既往的研究證明眾所周知，Th1/Th2的免疫失衡及其功能紊亂在哮喘的發(fā)病機制中起著十分重要的作用，哮喘患者均存在Th1/Th2失衡。免疫學上一般將IFN-γ和IL-4分別作為Th1和Th2細胞的特征性細胞因子。通過檢測這兩個細胞因子可以反映出Th1/Th2的極化狀態(tài)，判斷其失衡程度。而通過糾正Th亞群的失衡來實現對哮喘的治療，是治療哮喘有效的途徑。

MCP基本分子結構是半乳糖醛酸，以α-1，4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸酶。分子量在一萬到二萬之間，由于其分子量小，無抗原性，無毒性，水溶性好，容易被胃腸道吸收而進入血液系統發(fā)揮作用，對機體的特異性和非特異性免疫產生影響。MCP具有雙向免疫調節(jié)作用，其中主要包括: 激活巨噬細胞、增強巨噬細胞的吞噬功能自然殺傷細胞(NK)，調節(jié)和增加單核細胞毒作用，刺激產生相關的細胞因子，活化B淋巴細胞和T淋巴細胞，增強其作用，激活補體系統，調節(jié)紅細胞免疫，影響蛋白質的合成及抗體的生成，影響機體免疫信息：如調節(jié)炎癥中Th1/Th2失衡，調節(jié)CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例，調節(jié)cAMP和cGMP濃度和相對比值，參與調節(jié)神經-內分泌-免疫(NM)網絡，打破機體免疫系統損傷造成的免疫耐受，提高免疫系統對抗原的識別能力等。動物實驗證實，低分子柑桔果膠通過阻斷脂多糖信號通路抑制內毒素誘導的前炎癥反應[4]。McCarty等[5]研究表明MCP富含半乳糖單體，與Galectin-3有極強的親和性，通過結合腫瘤細胞表面豐富的Galectin-3，使得腫瘤的生長直接受到抑制，另一方面腫瘤生長的營養(yǎng)源也被切斷，因而抑制腫瘤的生長與轉移。目前國外已用于腫瘤領域的臨床治療。而在糖尿病、高血脂、鉛中毒等方面的防治也正成為研究的熱點[6]。是否MCP能用于哮喘的防治，目前國內外尚沒有報道。本實驗建立急性哮喘小鼠模型，以MCP作為干預藥物，初步探討其對哮喘氣道炎癥的調節(jié)作用及可能機制。

本實驗結果表明C組肺組織支氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤明顯減少，BALF液涂片EOS%較B組明顯下降，血清和BALF液中IL-4濃度降低，提示其有一定程度的抗炎及調整Th1/Th2的作用。MCP可能是通過增強免疫功能來糾正Th1/Th2失衡。但C組效果不及D組，提示其可作為有效的免疫調節(jié)劑輔佐糖皮質激素用于哮喘的治療，以期更好地控制哮喘，減少激素用量。C組NF-κB蛋白的表達較B組明顯降低，提示MCP有抑制NF-κB信號通路的作用，這也可能是其改善氣道炎癥、調節(jié)Th1/Th2失衡的又一分子機制。通過本實驗研究表明，MCP對氣道炎癥有一定的調節(jié)作用，其可能機制為： 通過抑制前炎癥因子的表達，進而抑制NF-κB信號通路的活化； 直接抑制NF-κB蛋白，阻斷NF-κB通路的信號傳遞。

MCP的應用劑量是根據臨床用于調節(jié)免疫功能的劑量轉換而來。因此，MCP合理的劑量范圍尚有待進一步研究確定。通過對本研究中量效關系的分析發(fā)現，MCP降低哮喘小鼠氣道炎癥，調節(jié)Th1/Th2失衡，阻斷NF-κB通路的信號傳遞。這些發(fā)現提示MCP可作為一種新的有免疫調節(jié)劑用于哮喘的治療，這將為支氣管哮喘的藥物和飲食治療開辟一條新的途徑。

參考文獻：

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[3]李昌崇，張維溪，陳小芳，等.巨嗜細胞炎性蛋白1α及其mRNA在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用[J].中華兒科雜志，2004，42(2):90

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[5]McCarty MF，Block KI.Toward a core nutraceutical program for cancer management[J].Integrative Cancer Therapies，2006，5(2):150

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Effect of Modified Citrus Pectin on the Expression of Nuclear Factor NF-Kappa B and Th1/Th2 Balance in Mice of Asthma

HUANG Juan,LIU Xiu-fen,ZHAO Hong-ling,et al

(XianningCentralHospital,XianningHubei437100，China)

ABSTRACT：Objective To discuss the role of nuclear factor kappa-B and Th1/Th2 immune imbalance in the model mice of asthma and the mechanism of low molecular citrus fruit powder. Methods BALB/c mice were randomly divided into four groups:the control group，asthma group ，MCP treated group and DXM treated group.In the experiment，the mouse model of asthma was established by the ovalbumin( OVA) challenge methods.The cell numbers and differentiated cell numbers in BALF were counted by different counting fluids；Application of ELISA methods to detect concentration IL-4，IFN-γ in BALF；The protein expression of NF-κB were detected by Immuno-histochemistry(IHC).Results Compared with asthma group，The level of IL-4 in serum and BALF of MCP treated group had a markedly decrease(P<0.05)；The protein expresstion of NF-κB in MCP treated group were significantly decrease than asthma group；There was a positive correlation between NF-κB in lung and IL-4 in BALF(P﹤0.05)，A negative correlation between the level of IFN-γin BALF(P<0.01).Conclusion Low molecular citrus fruit powder can reduce the inflammatory cytokines of IL-4，relieve lung tissue pathology damage in the mice mode of asthma.The mechanisms may be regulate Th1/Th2 balance and restrain the nf-kappa B activation，reduce airway epithelium nf-kappa B expression，so as to prevent the occurrence of asthma.

KEY WORDS：Modified Citrus Pectin；Asthma;NF-κB;IL-4;IFN-γ;Th1/Th2 balance

(收稿日期：2016-02-04)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.02.0102

中圖分類號：R-332

文獻標識碼：A

文章編號：2095-4646(2016)02-0102-04

基金項目：湖北科技學院校級科研項目(zx1314)

**通訊作者：E-mail:308138353@qq.com