維生素E對抗環(huán)磷酰胺對腎小管上皮細胞的毒性作用

高金祥　刁匯玲　王雅寧　董　華　張曉敏　呂　敏　賈振華　劉益濤

1　濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科　濱州　256603；2 濱州醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學教研室

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維生素E對抗環(huán)磷酰胺對腎小管上皮細胞的毒性作用

高金祥1刁匯玲2王雅寧1董華1張曉敏1呂敏1賈振華1劉益濤1

1濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科濱州256603；2 濱州醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學教研室

【摘要】目的研究維生素E抑制環(huán)磷酰胺所致腎小管上皮細胞毒性作用的影響。方法通過MTT和中性彗星實驗，分別觀察環(huán)磷酰胺單獨或與維生素E聯(lián)合應用時對腎小管上皮細胞生存率及DNA損傷的作用。結(jié)果與對照組相比，1、3 mol/L環(huán)磷酰胺處理腎小管上皮細胞12 h后可顯著降低細胞生存率，并可造成細胞的DNA損傷(P<0.05)；與環(huán)磷酰胺處理組相比，1 mmol/L維生素E顯著降低了環(huán)磷酰胺致腎小管上皮細胞DNA損傷的作用(P<0.05)，但對環(huán)磷酰胺降低腎小管上皮細胞生存率的作用無明顯影響(P>0.05)。結(jié)論維生素E對抗環(huán)磷酰胺致腎小管上皮細胞DNA損傷的作用。

【關(guān)鍵詞】環(huán)磷酰胺；維生素E；腎小管；上皮細胞

近年來環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)在臨床上廣泛應用于對激素依賴或?qū)に氐挚沟哪I病綜合征、狼瘡性腎炎等腎臟疾病[1，2]的治療。它在殺傷免疫細胞的同時，還降低了正常組織細胞的抗氧化能力，促進自由基過量生成，以致于正常細胞發(fā)生氧化應激反應，因此尋求一個既能降低其副作用又不減低療效的方法已成為當務之急。維生素E(vitamin E，VE)又稱生育酚，是臨床上常用的抗氧化藥物，可以清除自由基，阻斷脂質(zhì)過氧化，保護細胞和組織免受由自由基誘導的氧化損傷[3，4]。因此，VE與CTX聯(lián)合應用極有可能降低了CTX對正常腎組織細胞的損傷作用。本研究應用MTT實驗和中性彗星實驗，觀察了VE對CTX所誘發(fā)的正常腎小管上皮細胞毒性效應的保護作用，旨在為提高CTX藥用價值提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器人類腎小管上皮細胞株(HKC)，購自美國ATCC細胞庫；小牛血清及RPMI 1640購于Gibco公司；噻唑藍(MTT)和CTX購自sigma公司；Leica 倒置熒光顯微鏡(德國LEICA公司)；ELX-800酶標儀(美國Bio-TEK公司)；DYY-6D型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2MTT實驗將2×107L-1 HKC懸液以200 /孔接種于96孔板，實驗分為對照組(0 mol/L CTX)、0.1、0.3、1、3、10 mol/L CTX處理組，每組有5個復孔。細胞孵育6、12和24 h后，用酶標儀測吸光度值(A490nm)，進而計算細胞存活率[5]。

1.3中性彗星試驗HKC經(jīng)CTX處理后，細胞濃度調(diào)為6×1010L-1，制成三明治膠。用4?C細胞裂解液浸泡三明治膠內(nèi)細胞2 h，然后移至電泳槽內(nèi)，電泳30 min后鏡下觀察，comet score 軟件分析實驗結(jié)果[5]。

1.4統(tǒng)計學方法所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行單因素方差分析，并進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1不同濃度CTX對HKC存活率的影響如表1所示，與對照組相比，0.1 mol/L CTX對HKC無明顯毒性作用(P>0.05)；0.3 mol/L CTX處理細胞24 h后有較明顯的毒性作用(P<0.05)；1 mol/L CTX處理細胞12、24 h后，細胞存活率分別降為(87±7.42)%、(81±6.13)%；3、10 mol/L CTX在各個時間段都能明顯降低HKC的存活率(P<0.05)。據(jù)以上實驗結(jié)果得出，CTX對HKC存活率的影響具有時間、劑量效應。本研究選出1、3 mol/LCTX作用細胞12 h進行后續(xù)實驗。

表1　不同濃度CTX對HKC存活率的影響

注：與對照組相比，*P<0.05

2.2VE聯(lián)合CTX對HKC生存率的影響1和3 mol/L CTX處理HKC 12 h后，細胞存活率與對照組相比明顯下降(P<0.05)，但VE與CTX聯(lián)合應用后，細胞存活率比單獨應用CTX無明顯變化(P>0.05)，這表明1 mmol/L VE不能顯著減低CTX對HKC的細胞毒性，見表2。

表2　VE降低了CTX對HKC生存率的抑制作用

注：與對照組相比，*P<0.05；與CTX處理組相比，#P<0.05

2.3VE聯(lián)合CTX對細胞DNA損傷的影響如表3和圖1所示，1、3 mol/L CTX處理HKC 12 h后，彗尾長度和有尾細胞百分比與對照組明顯增加。CTX與1 mmol/L VE聯(lián)合應用時，彗尾的長度和有尾細胞百分比與CTX處理組相比明顯變短，但仍長于對照組(P<0.05)，這表明VE降低了CTX對細胞DNA的損傷。

表3　VE降低了CTX損傷細胞DNA的作用

注：與對照組相比，*P<0.05；與CTX處理組相比，#P<0.05

3討論

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，在殺傷腫瘤細胞的同時還具有免疫抑制的作用，因此在腎臟疾病的治療中得到了廣泛的應用。它進入體內(nèi)后可轉(zhuǎn)化為酰胺氮芥和丙烯醛，后者可破壞正常細胞氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)，所產(chǎn)生的自由基作用于DNA的脫氧核糖和堿基，導致DNA雙鏈斷裂及交聯(lián)[6]?？寡趸瘎￢E是否具有保護正常的腎臟組織免受CTX損傷的作用，成為本研究所關(guān)注的熱點。

本研究通過MTT實驗觀察到CTX對HKC的毒性作用具有時間和劑量效應。1、3 mol/L CTX處理細胞12 h后，HKC細胞存活率分別下降為(87±7.42)%、(85±5.23)%，與對照組相比具有顯著差異性。但是1、3 mol/L CTX與1 mmol/L VE聯(lián)合處理細胞時，細胞存活率與CTX單獨處理細胞

無明顯差異，這表明VE不能拮抗CTX對HKC的殺傷作用。

中性彗星實驗又稱單細胞凝膠電泳實驗，它能根據(jù)相同的電泳條件下遷移的DNA量(有尾細胞百分比)和DNA遷移部分的遷移長度(彗尾長度)來測定單個細胞DNA損傷程度[7]。本研究通過中性彗星實驗發(fā)現(xiàn)，1、3 mol/L CTX可導致HKC發(fā)生DNA損傷，1mmol/LVE降低了CTX對DNA的損傷，但是不能完全抑制CTX的損傷作用，這提示了VE可部分拮抗了CTX對HKC造成的DNA損傷作用。

綜上所述，VE可保護了正常的腎組織細胞免受CTX所誘導的細胞DNA損傷，其作用機制可能是VE作為脂溶性抗氧化劑，清除了CTX處理HKC后所產(chǎn)生的自由基和脂質(zhì)過氧化物，降低了后者所造成的細胞DNA損傷，但VE具體的作用機制還需要進一步探討。

參考文獻

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[7] Olive P L,Banáth J P.Growth fraction measured using the comet assay[J].Cell Prolif,1992,25(5):447-457.

Vitamin E inhibits the toxic effects of cyclophosphamide on human kidney tubular epithelial cell

GAO Jinxiang1DIAO Huiling2WANG Yaning1DONG Hua1ZHANG Xiaomin1LYU Min1JIA Zhenhua1LIU Yitao1

1 Department of Nephrology,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256603,P.R.China;2 Department of Physiology,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University

【Abstract】ObjectiveTo study the inhibitory action of vitamin E for the toxic effects of cyclophosphamide (CTX) on human kidney tubular epithelial cells (HKCs).MethodsMTT assay and neutral comet assay were separately used to observe the effect of CTX alone and in combine with vitamin E on the survival rate and DNA damage of HKCs.ResultsAfter 12h treatment, 1,3 mol/LCTX inhibited proliferation of HKCs and induced DNA damage of HKC (P<0.05) in comparison with control group.Compared with CTX treated group,Vitamin E decreased DNA damage induced by CTX (P<0.05).In addition,VE didn't change the HKC death induced by CTX (P>0.05).ConclusionsVE could inhibit the DNA damage of HKC induced by CTX.

【Keywords】cyclophosphamide,vitamin E,kidney tubule,epithelial cell

(收稿日期：2016-02-23 )

【中圖分類號】R692

【文獻標志碼】A

【文章編號】1001-9510(2016)02-0109-03

基金項目：濱州醫(yī)學院校級科技計劃(BY2009KJ38)

高金祥,E-mail：gjx751012@163.com