韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌抑制作用初探

曾 鳳 黃永紅 凌 鍵 茆振川 謝丙炎 楊宇紅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

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韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌抑制作用初探

曾 鳳 黃永紅 凌 鍵 茆振川 謝丙炎 楊宇紅*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

摘 要：采用離體抑菌測(cè)定和盆栽測(cè)定相結(jié)合的方法，研究了韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌1號(hào)生理小種的抑制作用和盆栽防治效果。結(jié)果表明：韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)速率以及孢子萌發(fā)率具有明顯的抑制作用，當(dāng)韭菜水提液濃度為0.75 g·mL-1時(shí)，菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到100%；當(dāng)韭菜水提液濃度為0.25 g·mL-1，處理20 h后觀察，孢子萌發(fā)抑制率達(dá)95.47%；在盆栽試驗(yàn)中，基質(zhì)中加入韭菜水提液濃度為0.086 g·g-1接種15 d后，甘藍(lán)枯萎病的防治效率可達(dá)40%，甘藍(lán)死亡率下降27%。

關(guān)鍵詞：韭菜；水提液；甘藍(lán)枯萎病菌；盆栽試驗(yàn)；抑制率

曾鳳，女，碩士研究生，專業(yè)方向：分子植物病理學(xué)，E-mail：474249677@qq.com

結(jié)球甘藍(lán)起源于地中海至北海沿岸，是世界上許多國(guó)家的主要蔬菜之一。目前，我國(guó)甘藍(lán)年種植面積約為90萬(wàn)hm2（楊麗梅 等，2011），在蔬菜的周年供應(yīng)和出口創(chuàng)匯方面起著重要作用。甘藍(lán)枯萎病作為甘藍(lán)上的重要病害之一，1895年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)（Smith，1899），如今在我國(guó)北京、河北等地發(fā)生并傳播迅速（李明遠(yuǎn) 等，2003），嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致毀收絕產(chǎn)，使甘藍(lán)種植產(chǎn)業(yè)蒙受巨大損失。當(dāng)前甘藍(lán)枯萎病的防治方法主要包括農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治等。農(nóng)業(yè)防治主要包括種子處理、輪作、清理病殘?bào)w以及選用抗病品種等，但是前幾種方法收效甚微，雖抗病品種防效很好，但目前國(guó)內(nèi)的抗病資源缺乏。而化學(xué)防治缺乏有效的藥劑。生物防治及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)成為目前研究熱點(diǎn)。其中，植物源殺菌劑是利用具有殺菌、抑菌活性的某些植物部位或提取其有效成分，或分離純化其單體物質(zhì)加工成用于防治病害的藥劑（李曉東 等，1995）。已有報(bào)道證實(shí)許多植物提取液以及分泌物能有效抵御病原菌的侵染，如韭菜提取液對(duì)香蕉枯萎病菌的菌絲以及孢子的抑制率可達(dá)98%，蔥汁液以及葡萄葉提取物也可抑制黃萎菌，另外有研究分析了植物源農(nóng)藥解決病原菌抗藥性問(wèn)題的可能性（何衍彪 等，2005；田菲菲 等，2006；周璇 等，2007；馮巖 等，2010；黃永紅 等，2011；葉倩 等，2013）。

在前人研究的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)探究了韭菜提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)速率、孢子萌發(fā)率的影響以及盆栽防治效果，旨在為甘藍(lán)枯萎病的綠色防治提供新的思路。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試菌株：尖孢鐮刀菌甘藍(lán)專化型（Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans）1號(hào)生理小種52557-TM（Foc）的標(biāo)準(zhǔn)菌株，由美國(guó)菌種保存中心（ATCC）提供，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所真菌病毒組保存。供試品種：韭菜品種為四季香韭，由北京鑫農(nóng)豐農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所選育而成；甘藍(lán)品種為中甘21號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育而成。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2015年5月1日至7月30日在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所真菌病毒組實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的離體抑制測(cè)定

1.2.1.1韭菜水提液制備 取洗凈晾干的韭菜100 g ，切成5 cm的小段，加20 mL蒸餾水，用榨汁機(jī)打碎，裝入離心管，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，共離心4次，直至上清液呈透明色，再用0.22 μm細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾上清液，得到濃度為5.0 g·mL-1的水提原液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的抑制測(cè)定 取Φ9 cm的培養(yǎng)皿，分別加入0、1、2、3 mL的上述韭菜水提原液，用無(wú)菌蒸餾水將體積補(bǔ)充至3 mL。將冷卻至37 ℃左右的PDA培養(yǎng)基倒入上述不同處理的培養(yǎng)皿中，每皿20 mL，混勻，此時(shí)韭菜水提液濃度分別為0（CK）、0.25、0.50、0.75 g·mL-14個(gè)濃度梯度。取一新鮮Foc平板，用Φ0.8 cm打孔器打成大小一致的菌餅，取1個(gè)菌餅倒置接到各處理的培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)濃度梯度重復(fù)3皿，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 d，每天采用“十”字交叉法測(cè)量菌落大小，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.2.1.3對(duì)孢子萌發(fā)的抑制測(cè)定 在500 mL的三角瓶中加入PDB培養(yǎng)基200 mL，接入Foc菌絲進(jìn)行培養(yǎng)，28 ℃、150 r·min-1搖培4 d后，用4層擦鏡紙過(guò)濾（Li et al．，2015），5 000 r·min-1離心10 min后收集孢子。將收集的孢子用新的PDB培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，調(diào)整孢子濃度為1×107個(gè)·mL-1，取200 μL分別添加到12個(gè)裝有500 μL PDB培養(yǎng)基的2.0 mL離心管中。再分別加入0、50、100、200 μL上述韭菜水提原液，最后用無(wú)菌水補(bǔ)充總體積為1 mL，此時(shí)韭菜水提液被稀釋成0（CK）、0.25、0.50、1.00 g·mL-1。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)總共200 μL，10、20 h后，用普通光學(xué)電鏡觀察孢子萌發(fā)情況，每個(gè)重復(fù)觀察3次，共觀察約100個(gè)孢子。

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子總數(shù)/孢子總數(shù)×100%

孢子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100%

1.2.2韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病的盆栽防效測(cè)定

1.2.2.1韭菜水提液制備 取洗凈晾干的韭菜200 g，切成5 cm的小段，加100 mL水，用榨汁機(jī)打碎，加水至1 000 mL，配制成0.2 g·mL-1的溶液備用。

1.2.2.2土壤處理 分別取0、15、30 mL上述韭菜提取液，與70 g的基質(zhì)混勻，裝入營(yíng)養(yǎng)缽中，此時(shí)韭菜水提液濃度分別為0（CK）、0.043、0.086 g·g-1。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)種15～20株甘藍(lán)苗。

1.2.2.3盆栽接種 將3葉1心期的甘藍(lán)幼苗在濃度為1×106個(gè)·mL-1的甘藍(lán)枯萎病1號(hào)生理小種孢子懸浮液中浸泡20 min，移栽到上述營(yíng)養(yǎng)缽中，放入28 ℃溫室中培養(yǎng)，8 d后開始調(diào)查植株發(fā)病情況，并根據(jù)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)癥狀；1級(jí)，1片葉輕微變黃；2級(jí)，1～2片葉葉脈輕至中度變黃：3級(jí)，除心葉外，其余葉片中度變黃或萎蔫；4級(jí)，全部葉片重度變黃或萎蔫；5級(jí)，葉片完全萎蔫并變黃（Li et al．，2015）。

病情指數(shù)=Σ（各級(jí)發(fā)病數(shù)×各級(jí)代表值）/（處理總數(shù)×最高級(jí)代表值）×100

2　結(jié)果與分析

2.1韭菜水提取液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

圖1　韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響

圖2　接種后6 d韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的抑制效果

韭菜水提取液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌菌絲的生長(zhǎng)速率具有明顯的抑制作用，隨著提取液濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)；接種6 d后，當(dāng)濃度達(dá)到0.75 g·mL-1時(shí)，病原菌完全停止生長(zhǎng)，抑制率達(dá)到100%（圖1、2）。

2.2韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌孢子萌發(fā)率的影響

由圖2可知，在濃度為0.25 g·mL-1韭菜提取液的PDB培養(yǎng)基中，甘藍(lán)枯萎病菌的孢子萌發(fā)明顯受到抑制，10 h后處理萌發(fā)率僅有0.65%，對(duì)照為21.16%；20 h后處理萌發(fā)率為2.56%，而對(duì)照高達(dá)56.57%，抑制率可達(dá)95.47%（圖3）。視野中幾乎未看到明顯的孢子萌發(fā)痕跡（圖4）。

圖3　韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌孢子萌發(fā)率的影響

圖4　接種后20 h孢子萌發(fā)情況（光學(xué)電鏡，20×）

圖5　韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病的盆栽防效

圖6　接種后第16天甘藍(lán)幼苗的生長(zhǎng)情況

2.3韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病的盆栽防效

由圖5可知，隨著處理土壤中加入韭菜水提液濃度的增加，甘藍(lán)枯萎病病情指數(shù)顯著降低。當(dāng)接種14 d時(shí)，對(duì)照的病情指數(shù)為61.38，而韭菜水提液濃度為0.043 g·g-1和0.086 g·g-1處理的病情指數(shù)分別為42.73、11.33，防治效果分別達(dá)到30.39%、81.54%；韭菜水提液濃度為0.086 g·g-1處理接種15 d時(shí)對(duì)甘藍(lán)枯萎病的防效可達(dá)40%，甘藍(lán)死亡率下降27%，說(shuō)明韭菜提取液對(duì)減輕甘藍(lán)枯萎病發(fā)病程度具有很好的作用；接種16 d后，對(duì)照幾乎全部死亡，而韭菜水提液濃度為0.043 g·g-1和0.086 g·g-1處理的甘藍(lán)苗仍可正常生長(zhǎng)，尤其是韭菜水提液濃度為0.086 g·g-1的處理長(zhǎng)勢(shì)良好（圖6）。但是接種后15 d防效有所降低，表明其持效期可能為14 d左右。

3　結(jié)論與討論

甘藍(lán)枯萎病是土傳性病害，可以通過(guò)多種方式進(jìn)行傳播，如地下昆蟲、水流以及農(nóng)事操作等，有時(shí)種子也可以帶菌傳播，而近年來(lái)發(fā)生情況愈加嚴(yán)重，危害面積快速上升，可造成甘藍(lán)產(chǎn)量損失高達(dá)30%以上（張揚(yáng) 等，2007）。目前很難找到有效、安全的方法防治該病害，所以尋找一種高效、無(wú)毒的防治方法具有非常重要的意義。

本試驗(yàn)通過(guò)研究韭菜水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病病原菌的作用，從菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)以及病原菌致病力等方面展開試驗(yàn)，結(jié)果表明：韭菜粗水提液對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌具有明顯的抑制作用，這為甘藍(lán)枯萎病的防治提供了一種新的參考。但是，本試驗(yàn)只是初步試驗(yàn)，不夠深入，如何進(jìn)一步研究韭菜水提液的殺菌活性以及獲得韭菜中的殺菌物質(zhì)，并運(yùn)用到大田中還需要繼續(xù)思考。韭菜及其相關(guān)產(chǎn)物的開發(fā)利用，可能為將來(lái)病害的防治提供了高效、安全、環(huán)境友好型的新型藥劑。

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Primary Studies on Inhibitory Effect of Water Extracts from Allium tuberosum on Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans in Cabbage

ZENG Feng，HUANG Yong-hong，LING Jian，MAO Zhen-chuan，XIE Bing-yan，YANG Yu-hong*
（Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：This paper studied the inhibition role of water extracts from Allium tuberosum on Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans（Foc）and control effect of pot cultivation by combining in vitro antibacterial assay with potted plant measurement. The result indicated that extracts could clearly suppress mycelia growth and spore germination．The inhibition rate was up to 100% when the concentration of waterextracts reached 0.75 g·mL-1. The spore germination inhibition rate reached 95.47% when the added leek extract concentration came to 0.25 g·mL-1and was deal with 20 hours. In pot experiments， the disease control efficiency can reach 40%，and mortality fell by 27% 15 days after the treatment when the concentration of waterextracts reached 0.086 g·g-1in the culture substrate.

Key words：Allium tuberosum；Water extract；Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans；Potted plant experiment；Inhibition rate

*通訊作者（

Corresponding author）：楊宇紅，女，研究員，專業(yè)方向：植物病理學(xué)，E-mail：yangyuhong@caas.cn

收稿日期：2015-08-19；接受日期：2015-11-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303014），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-25-B-01），中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS），農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目