激活葡萄糖腦苷酯酶對帕金森病患者皮膚成纖維細胞自噬活性的影響

陳艷紅　孫濤

442000　十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院中醫(yī)康復綜合部(陳艷紅)；十堰市人民醫(yī)院湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院泌尿外科[孫濤(通信作者)]

?

激活葡萄糖腦苷酯酶對帕金森病患者皮膚成纖維細胞自噬活性的影響

陳艷紅孫濤

442000十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院中醫(yī)康復綜合部(陳艷紅)；十堰市人民醫(yī)院湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院泌尿外科[孫濤(通信作者)]

【摘要】目的探討激活葡萄糖腦苷脂酶(GBA)對帕金森病患者皮膚成纖維細胞自噬活性的影響。方法取32例帕金森病患者的皮膚標本進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，運用含有雷帕霉素及不含雷帕霉素的GBA培養(yǎng)基分別進行體外培養(yǎng)，用蛋白印跡法檢測自噬體的經(jīng)典標記物微管相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果雷帕霉素處理后 Beclin 1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白的表達水平增高(P<0．05)，而a-synuclein表達水平則下降(P<0．05)。結(jié)論激活GBA可以強化自噬水平，降低a-synuclein蛋白的表達。

【關(guān)鍵詞】葡萄糖腦苷脂酶a-突觸核蛋白自噬

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.02.011

帕金森病(Parkinson’ s Disease, PD)是人類常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，a-突觸核蛋白(a-synuclein, a-syn)或者功能異常的細胞器(如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)的降解障礙都是導致PD發(fā)生的重要因素，有研究表明 a-突觸核蛋白與葡萄糖腦苷脂酶(glucocerebrosidase gene，GBA)蛋白的缺乏在PD的發(fā)病中起到了一個雙向環(huán)路的作用[1]。自噬-溶酶體途徑(Autophagy-lysosome pathway, ALP)是細胞內(nèi)重要的蛋白降解途徑,尤其在清除異常聚集的a-突觸核蛋白中發(fā)揮著重要作用，GBA是溶酶體內(nèi)的一種酶，且GBA與a-突觸核蛋白可相互影響，因此有學者推測GBA在自噬、溶酶體和調(diào)控a-syn的表達中發(fā)揮著某種作用。為此，本實驗旨在探討GBA對自噬的調(diào)控及a-syn的影響。

1材料與方法

1.1實驗材料及病例資料

1.1.1主要試劑及儀器鼠抗人8-Glc單克隆抗體及羊抗鼠IgG均購自上海藍基生物公司(上海，中國)，取皮器產(chǎn)(日本)，酶標儀(Bio-Rad，USA)，自動洗板機(MODEL1575，USA)，臺式高速離心機(TGL-16G，中國)，紅外熒光掃描成像儀。

1.1.2病例資料選擇2013年9月～ 2015年9月在湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院神經(jīng)科及老年病科就診的患者，其均符合原發(fā)性PD的標準診斷[2]。所有患者均由同一位醫(yī)生間斷3次評估，排除帕金森綜合癥。原發(fā)性帕金森病組病例組共32例，其中男17例，女15例，平均年齡(59.08±7.01)歲。

1.2方法

1.2.1標本采集取患者皮膚進行成纖維細胞培養(yǎng)，所有受試者均簽署知情同意書。上臂背側(cè)肘關(guān)節(jié)常規(guī)消毒皮膚，利多卡因局部浸潤麻醉后用打孔機樣取皮器旋取皮膚標本，置入加抗生素的的青霉素瓶中，在超凈臺內(nèi)將標本轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，用眼科剪修剪，去除皮下脂肪組織，并將標本剪碎，取皮后創(chuàng)口消毒、壓迫止血，用無菌紗布加壓包扎。

1.2.2細胞培養(yǎng)帕金森病患者皮膚成纖維細胞用DMEM培養(yǎng)基、體積分數(shù)為0．10的胎牛血清、抗生素，于37℃ CO2孵箱中進行原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，當細胞傳代生長達到一定規(guī)模后可以將部分細胞冷凍保存?zhèn)溆?凍存的細胞應(yīng)該處在生長良好(即處于對數(shù)生長期)且存活率高(90%以上)的狀態(tài)。

1.2.3分組通過細胞計數(shù)取適量細胞，根據(jù)培養(yǎng)基種類分為兩組，A組(不含雷帕霉素)及B組(含有雷帕霉素)。

1.2.4Western印跡雜交分析蛋白表達水平A組及B組培養(yǎng)成纖維細胞4 d后收集并裂解細胞，定量取蛋白行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗(鼠抗人8一Glc單克隆抗體，體積比為1∶500)室溫作用1 h后洗膜3次，再與二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，體積比為1∶500)室溫反應(yīng)1 h，洗膜后行ECL光化學法顯色，暗室下行x線膠片曝光，內(nèi)參為GAPDH。2組Western blot蛋白條帶用平均吸光度值表示。

2結(jié)果

2組皮膚成纖維細胞內(nèi)源性Beclin 1、LC3-II/LC3-l、a-synuclein的表達水平

A組與B組內(nèi)源性Beclin 1、LC3-II/LC3-l、a-synuclein蛋白的濃度比較有顯著差異(P<0.05)；A組a-synuclein的水平[(3.869±1.292)ng/mL]明顯高于對照組[(2.922±0.804)ng/mL]；A組Beclin-1的水平及LC3-II/LC3-I比值明顯低于對照組(表1)。

3結(jié)論

帕金森病的患病因素包括遺傳易感性、年齡、老化及環(huán)境等多種環(huán)節(jié)。有多項研究表明自噬與帕金森病有密切的聯(lián)系,自噬的失調(diào)對PD的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用,但是目前關(guān)于在PD患者活體內(nèi)自噬功能的研究還很少。本研究主要通過GBA培養(yǎng)基激活其活性，誘導自噬,發(fā)揮其清除胞漿內(nèi)異常蛋白質(zhì)或細胞器的功能。

表1　2組血漿a-synuclein、Beclin 1、LC3-II/LC3-l比較

注：32例PD患者檢測寡聚體水平時，其中有2例患者因其OD值小于檢測范圍，因無具體數(shù)值，故未納入比較；與A組比較，*P<0.05

自噬的發(fā)生及發(fā)展的分子機制十分復雜，但卻有相當高的相似性。Komatsu M通過對酵母的研究發(fā)現(xiàn)，高等真核生物與酵母有類似的自噬分子機制[3]。自噬體標記物有多種蛋白，其中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC-3)是一種經(jīng)典的標記物[4]，LC-3I(18KD)和LC-3II(16KD)是細胞內(nèi)兩種主要形式LC-3。一般情況下自噬激活后LC-3I就被活化，在泛素樣反應(yīng)酶的作用下與隣脂酰乙醇胺偶聯(lián)生成LC-3II。因此,LC-3II的量與自噬小體的形成有緊密的聯(lián)系,而LC-3II與LC-3I的比值是反映自噬活性的可靠指標[5-6]。因此，本實驗選用觀察LC3的表達水平判斷PD患者皮膚成纖維細胞的自噬情況,直接觀察指標為LC-3II與LC-3I的比值。本研究B組Beclin1蛋白水平明顯高于A組，通過培養(yǎng)基激活GCA使Beclin1蛋白水平表達明顯上調(diào)，同時B組LC3II/LC3-I比值也明顯高于A組，由此可見激活GCA可以上調(diào)自噬水平。但B組a-syn的水平明顯低于A組,提示激活GCA可以使a-syn突觸核蛋白表達降低。過表達GBA一方面可以上調(diào)自噬水平；另一方面又能使突觸核蛋白表達降低。其機制可能為自噬可降解異常蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)通常來自于誘發(fā)損傷的早期死亡細胞，或者清除異常的蛋白質(zhì)和(或)失活的細胞器[7]，從而對神經(jīng)元起保護作用，反過來神經(jīng)細胞內(nèi)的自噬被抑制后會導致神經(jīng)元變性及異常蛋白質(zhì)的積聚，激活GBA可促進a-syn分解代謝，低水平的a-syn又促進了GBA蛋白的活化，而GBA活性的改變反過來又加速了a-syn的清除。由此推測激活GBA可能通過自噬降低了a-syn的表達水平。

本研究結(jié)果表明，激活GBA不僅可以強化自噬水平，還可以降低a-syn的表達， PD患者活體皮膚成纖維細胞自噬功能的檢測為闡明PD的發(fā)病機制提供了理論依據(jù)。另外，雷帕霉素對PD患者成纖維細胞的影響也可能為藥物治療PD提供了新的思路，但該結(jié)論及具體機制還需要擴大樣本量進一步研究。

參考文獻

[1]Tan EK,Tong J,Fook-Chong S,et al.Glucocerebrosidase mutations and risk of Parkinson disease in Chinese patients[J].Arch Neurol,2007,64(7):1056-1058.

[2]吳江.神經(jīng)病學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005.

[3]Komatsu M,Waguri S,Chiba T,et al.Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice[J].Nature,2006,441(795):880-884.

[4]Tanida I,Ueno T,Kominami E.LC3 conjugation system in mammalian autophagy[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36(12):2503-2518.

[5]Bursch W.The autophagosomal-Iysosomal compartment in programmed cell death[J].Cell Death Differ,2001,8(6):569-581.

[6]Mizushima N,Yoshimori T,Levine B.Methods in mammalian autophagy research[J].Cell,2010,140(3):313-326.

[7]pan T,Rawal P,Wu Y,et al.Rapamycin protects against rotenone-induced apoptosis through autophagy induction[J].Neuroscience,2009,164(2):541-551.

(2015-12-16收稿2016-03-02修回)

Effect of activation of glucocerebrosidase on autophagotrophic activity of skin fibroblasts in Parkinson's patients

ChenYanhong,SunTao.

DepartmentofGeriatrics,TaiheHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan442000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of activation of glucocerebrosidase on autophagotrophic activity of skin fibroblasts in Parkinson's patients. Methods32 cases of Parkinson's disease were selected. Fibroblast cells were cultured in vitro with rapamycin or without rapamycin GBA culture medium respectively. Microtubule associated protein phage classic markers expression were detected by protein imprintting method. ResultsBeclin 1 and LC3 - Ⅱ/LC3 - I protein expression level increased (P<0.05), while a - synuclein expression level decreased (P<0.05). ConclusionGBA activity can strengthen autophagy and reduce a - synuclein protein expression.

【Key words】Glucocerebrosidasea-synucleinAutophagy

【中圖分類號】R742.5

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2016)02-0114-03

基金項目：2015年湖北省教育廳科學研究計項目劃指導性(項目編號為B2015473)